基于PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物在药物递送和抗原佐剂系统的研究

发布时间：2020-09-21 21:13

　　恶性肿瘤是目前最危害人类健康的疾病之一。虽然现在化学疗法、放射疗法等治疗方法在临床上用于抑制肿瘤增殖和延长病人寿命等方面取得了巨大成功。但越来越多的实践和研究中发现单一治疗形式已经不能完全消除肿瘤且难以预防肿瘤转移。因此,要克服单一疗法的限制性,采用两种或更多种形式的联合治疗方法被认为是替代单一治疗的有效方法。先进的纳米技术可对多功能纳米材料进行智能设计并用于共递送、共组装两种或多种治疗药物,为肿瘤联合治疗的设想提供了有力的支持。免疫治疗是一种完全不同于化学疗法的治疗方式。它是通过激活或重建病人免疫系统并改变肿瘤微环境,使机体对肿瘤细胞重新产生识别和杀伤能力的一种治疗方法。这种治疗方法对机体正常细胞不产生损坏,却能抑制肿瘤的复发和转移,并且由于记忆功能的存在而具有长期免疫的效果,因此得到了广泛关注。聚合物纳米粒具有强大的整合和包载诊疗试剂的能力,良好的生物相容性和可降解性,灵活的设计性和可修饰性等特征使得其作为药物递送载体在肿瘤治疗中脱颖而出。两亲性嵌段聚合物在水相中最终形成的结构取决于嵌段共聚物的亲、疏水性嵌段的比例以及聚合物分子量。因此,我们基于两亲性三嵌段聚合物PCL-b-PEG-b-PCL,通过调节PEG和PCL的质量比例分别获得自组装成聚合物纳米囊泡和聚合物纳米胶束的两种材料并对其在化疗-光热联合治疗以及免疫治疗中的应用进行了探索。具体内容如下:1.LHRH/TAT双肽并载DOX/PTX/ICG聚合物囊泡联合化疗-光热治疗肿瘤的研究本研究基于还原响应型两亲性三嵌段共聚物PCL-ss-PEG-ss-PCL,采用薄膜-水化-超声分散法制得粒径分布均一的聚合物囊泡并偶联氨基化的LHRH、cys-TAT,同时包载DOX、PTX、ICG构建出LHRH/TAT双重化疗药物联合使用和化疗-光热治疗的联合疗法。对载药聚合物囊泡进行粒径、分散度、Zeta电位(ξ)和形态结构表征,DOX、ICG、PTX载药量和包封率测定,体外热成像评价,DOX和PTX体外释放研究,体外细胞摄取及细胞毒性评价,研究表明采用薄膜-水化-超声法制得的双肽共负载DOX/PTX/ICG的聚合物囊泡粒径分布均一,对药物有较高载药量,具有还原响应性、药物缓释性能及良好的光热转换效率,可通过双肽作用有效实现细胞高效内吞,通过联合化疗-光热治疗具有较高的细胞杀伤能力。2.包载抗原和IMQ/MPLA的阳离子脂质聚合物纳米粒及其免疫性能研究本研究构建了一种新型多功能脂质聚合物纳米粒(liqid-polymer hybrid nanoparticles,LPNPs)疫苗系统,共同包载具有协同效应的抗原和两种Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)激动剂。采用 OVA 作为抗原,TLR7 激动剂 MQ 和 TLR4激动剂MPLA作为佐剂,PCL-b-PEG-b-PCL作为载体材料并添加阳离子1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)脂质通过薄膜-水化-超声-吸附法制备得到粒径均一的阳离子脂质聚合物纳米粒。结果表明,阳离子脂质聚合物纳米粒能显著提高DCs细胞对抗原的摄取,有效诱导体外DCs成熟,并促进体内DCs向次级淋巴结的迁移。皮下注射载OVA的阳离子脂质聚合物纳米粒后,交叉提呈水平、细胞因子分泌、长效记忆性免疫等有效提高并对肿瘤有较好的预防能力。3.靶向共传递抗原和佐剂聚合物纳米粒及其肿瘤免疫研究通过连接甘露糖配体制得靶向树突状细胞DCs的聚合物杂化纳米粒。共包载抗原和佐剂后,对其进行免疫效果评估。包括形态结构分析,粒径分析,体外释放行为,体外细胞毒性试验,体外细胞摄取,体外促成熟实验,注射部位药物代谢分析,体内DCs细胞向次级淋巴结的迁移,动物免疫实验以及预防型实验等。结果表明,制备得到的靶向共传递抗原和佐剂聚合物纳米粒具有良好的生物相容性,显著地提高体外促DCs成熟效果且能诱导产生更多的抗原特异性CD8+T细胞,更强的淋巴细胞活化,更有效地交叉提呈以及更多的记忆性T细胞、抗体、颗粒酶B、IFN-γ同时显著延迟小鼠肿瘤的发展。因此,这种共递送抗原和佐剂、DCs靶向的阳离子聚合物纳米粒用于癌症免疫疗法的一种极具潜力的抗原递送系统。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R943
【部分图文】：

两亲性嵌段共聚物,成胶,自组装

的介质隔离开，同时起到了载体和保护的作用。而它的亲水性内腔可以用来包载诸逡逑多亲水性药物，比如蛋白质、生长因子、ＤＮＡ和ＲＮＡ片段。聚合物囊泡的结构及逡逑应用如图１－１所示。由于独特的结构，同时包载亲水性和疏水性药物的能力，较好逡逑的可控性和生物稳定性，聚合物囊泡作为新型的药物载体得到了广泛的应用。逡逑两亲性共聚物逡逑昝蛋白质、生长因子〕逡逑＾邋—逦赚亲水性逡逑疏水性药物—包载在疏水性逡逑双籽膜层中逡逑图ｉ－ｉ．聚合物囊泡的结构及应用逡逑在过去的几十年中，生物相容性聚合物胶束作为药物的递送载体也同样得到了逡逑瞩目发展。这与它们通过两亲性嵌段自组装后形成的疏水性内核－亲水性外壳的结构逡逑形态有关。如图１－２所示［７，邋８］。与聚合物囊泡相似，聚合物胶束的亲水性外壳可以逡逑包载亲水性药物并与靶向分子连接，起到靶向治疗肿瘤的作用。它的疏水性内核则逡逑用于包载疏水性药物。胶束制备过程简单，无需添加有毒的有机溶剂和表面活性剂，逡逑从而使得胶束具有良好的生物相容性［９］。同时，聚合物胶束具有粒径小，生物降解逡逑性好，结构设计的高灵活性以及容易被化学修饰等优点［１０］。一些研宄表明这些聚逡逑合物纳米胶束可以显著提高化疗药物抗肿瘤效率并明显减少各种副作用［７

过程图,过程,聚合物,包封率

法和进一步的药物装载过程，包载了疏水性药物ＰＴＸ、两亲性药物ＤＯＸ、光热转逡逑换剂ＩＣＧ，并成功连接穿膜肽ＴＡＴ和靶向分子ＬＨＲＨ，从而实现了靶向－化疗－光热逡逑治疗的联合治疗。图２－１显示了载药聚合物囊泡ＤＰＩＮＰｓ的制备过程。经薄膜水化逡逑超声法制备的载ＰＴＸ、ＩＣＧ聚合物囊泡溶液ＰＩＮＰｓ为澄清透明并带乳光的绿色溶液。逡逑加入ＤＯＸ并在６５邋°Ｃ恒温搅拌２邋ｈ后成为澄清透明并带有乳光的红棕色溶液（图逡逑２－２Ａ）。通过原子力显微镜测得ＤＰＩＮＰｓ的形态结构为粒径均一的典型球体（图２－２Ｂ）。逡逑用ＮａｎｏＺＳ邋Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ粒径仪测量的ＰＩＮＰｓ聚合物囊泡溶液以及ＤＰＩＮＰｓ聚合物囊泡逡逑溶液的粒径分别为邋１６７．８７±邋１．８７邋ｎｍ、２３２．４７±邋１．４７邋ｎｍ，ＰＤＩ邋分别为邋０．１１６、０．１２７，逡逑表明亲水性ＤＯＸ的载入使聚合物囊泡的粒径增加了邋６４．６邋ｎｍ但并没有影响聚合物逡逑囊泡的粒径分散度。图２－２Ｃ为ＤＰＩＮＰｓ的粒径分布，证实了通过薄膜水化超声法制逡逑得的聚合物囊泡是粒径分布均一且粒径在２００邋ｎｍ左右的纳米粒。这个粒径远远小逡逑于７００邋ｒｎｎ，因此可以获得良好的被动靶向能力（ＥＰＲ效应）。游离ＤＯＸ溶液带有逡逑明显的正电荷，因此载入ＤＯＸ后载药聚合物囊泡的电位从－２３．８７邋ｍＶ增加到－１１．６逡逑ｍＶ。通过高速离心后取上清的方法可有效测出载药聚合物囊泡的载药量和包封率。逡逑其中，ＤＯＸ包封率为１３．５５邋％，载药量为２．０６邋％；邋ＩＣＧ包封率为９６．００邋％，载药量逡逑为９．８６邋％；邋ＰＴＸ包封率为８６．９０邋％

形态结构,聚合物,激光

使用含有１０邋ｍＭ邋ＧＳＨ＋１Ｍ水杨酸钠的ＰＢＳ溶液（ｐＨ邋７．４）为透析液，ＭＷＣＯ逡逑８，０００－１４，０００邋Ｄａ截留分子量的透析袋，在３７邋°Ｃ恒温摇床上评估聚合物囊泡ＤＰＩＮＰｓ逡逑的体外释放行为。图２－３Ａ显示ＤＯＸ的释放曲线呈双相释放模式。药物释放初期，逡逑吸附在聚合物囊泡表面的亲水性ＤＯＸ快速释放。在释放４８邋ｈ后，未激光组、激光逡逑组、ＧＳＨ未激光组、ＧＳＨ激光组的ＤＯＸ累积百分释放率可分别达４５．２６邋％、４５．８１邋％、逡逑６６．６９％、６８．３１％。随后，由于ＤＯＸ在聚合物囊泡膜层中的扩散引起之后的缓慢释逡逑放行为。同时，ＧＳＨ不断裂解聚合物材料中的－ｓｓ－键，因此ＧＳＨ组ＤＯＸ累积百分逡逑释放率明显高于不加ＧＳＨ组。激光对ＤＯＸ的释放行为并没有明显的促进作用。逡逑聚合物囊泡的ＰＴＸ在释放初期并没有突释行为，而是长期的缓慢持续释放（图逡逑２－３Ｂ）。造成这种现象的原因可能是疏水性ＰＴＸ和疏水性ＰＣＬ膜层之间较强的作用逡逑力。同时ＧＳＨ对ＰＴＸ的释放也有明显的促进作用，而激光组和未激光组的释放速逡逑率只能有稍微的差距。体外释放实验说明用ＰＣＬ－ｓｓ－ＰＥＧ－ｓｓ－ＰＣＬ合成的聚合物囊泡逡逑具有良好的还原敏感性，同时激光对药物的体外释放也有一定的增强作用。逡逑２０逡逑

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