FNC抗柯萨奇病毒B3活性及机制研究

发布时间：2020-10-01 17:16

　　目的病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是由柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)感染引发的机体免疫反应,主要发病于青少年和儿童,常表现为心肌细胞坏死、炎症细胞浸润,进一步发展为慢性心肌病、扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)和充血性心衰,严重的可导致急性心力衰竭甚至引发猝死。然而,目前VMC的发病机理仍不清晰,尚且缺乏高效精准的治疗方法及安全有效的治疗药物,因此,探索病毒性心肌炎症的发病机制,为临床寻找安全、有效的治疗药物极其重要。FNC是一种新型的核苷类似物,前期的研究表明其具有非常明显的抗艾滋病毒(HIV)以及抗乙型肝炎病毒(HBV)功效,但关于其抗柯萨奇病毒B3的研究未见报道。因此,本课题通过建立病毒性心肌炎体外细胞模型以及体内动物模型,探索FNC的抗CVB3活性以及对心肌损伤、炎性浸润的治疗作用,为寻找高效低毒的抗病毒药物提供理论依据。方法1体外研究1.1药效实验采用终点稀释法测定本实验所用CVB3的滴度TCID_(50),选取合适的病毒感染量;通过CVB3感染生长状态良好的Hela细胞,建立VMC细胞模型;采用MTT法及三种不同的给药方法,检测FNC体外抗CVB3活性及作用方式。1.2机制研究根据FNC的有效剂量,通过RT-PCR法,检测FNC体外对病毒、免疫应答及炎症相关基因表达的影响;通过Western Blot法检测FNC对NF-κB蛋白表达的影响。2体内研究2.1药效实验通过雄性Balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒稀释液,建立VMC动物模型,连续灌胃给药一周,观察小鼠状态、记录体重变化;摘眼球取血,采用ELISA法测定各组小鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及谷草转氨酶(AST)活性的变化;进行小鼠心肌组织病理学检查,评价FNC对VMC小鼠心肌的保护作用。2.2机制研究通过RT-PCR法检测FNC对病毒基因在小鼠心脏、胰腺以及肝脏中表达水平的影响;采用ELISA法检测FNC对血清中炎症因子IL-4,IL-6和TNF-α分泌的影响。结果1体外研究1.1药效实验结果CVB3滴度TCID_(50)为10~(-7.8)。FNC对Hela细胞的半数毒性浓度TC_(50)为858.517±44.099μg/ml,对CVB3病毒的半数抑制浓度IC_(50)为1.834±1.711 ng/ml,治疗指数TI为4.681×10~5;阳性对照药物利巴韦林的TC_(50)值为209.117±46.042μg/m,IC_(50)为7.343±3.028μg/ml,TI为28.478。结果表明,FNC可以通过预防、治疗以及直接作用病毒三种方式发挥很好的抗CVB3活性,其中治疗法效果最好。1.2机制研究结果RT-PCR结果显示,基因水平上,FNC对CVB3病毒衣壳基因VP-1的表达具有明显抑制作用,同时下调固有免疫反应相关基因TLR3、TLR7、RIG-1、MDA-5、NF-κB以及炎症相关基因IL-4、IL-6、TNF-α的表达(P0.05);Western Blot实验表明,在蛋白水平上,病毒感染后细胞中的NF-κB蛋白表达上调,而FNC能够有效抑制其表达,发挥抗炎症作用(P0.05)。2体内研究2.1药效实验结果成功构建VMC小鼠模型,结果显示,FNC可有效缓解病毒性心肌炎症状,降低血清心肌酶活性。另外,病理组织切片结果也直观表明FNC可抑制心肌坏死及炎性浸润,对病毒性心肌炎有很好的治疗作用。2.2机制研究结果FNC不仅有效抑制心肌炎小鼠心脏、胰腺、肝脏中的CVB3病毒的复制,而且能抑制血清中炎症因子IL-4,IL-6和TNF-α的表达,同时发挥抗病毒、抗炎症的作用(P0.05)。结论1.FNC在体内、体外皆具有显著的抗CVB3活性。2.FNC发挥抗CVB3活性的机制可能与抑制病毒复制及炎症反应有关。3.FNC抑制病毒复制的方式主要为进入细胞,抑制病毒的生物合成。4.FNC可能通过下调固有免疫识别受体的表达,抑制NF-κB信号通路,减少炎症因子分泌,降低炎症损伤。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【文章目录】：
摘要
abstract
引言
第一部分 FNC体外抗柯萨奇病毒B3活性及机制研究
    1 材料与仪器
        1.1 实验细胞
        1.2 实验病毒
        1.3 实验药物
        1.4 主要试剂
        1.5 主要仪器
        1.6 溶液配置
    2 实验方法
        2.1 FNC体外抗CVB3药效学实验
            2.1.1 细胞的复苏、培养、传代和冻存
            2.1.2 FNC对Hela细胞的毒性测定
            2.1.3 CVB3病毒扩增
            2.1.4 CVB3滴度测定
            2.1.5 FNC体外抗CVB3活性实验
            2.1.6 三种作用方式检测FNC体外抗CVB3活性
        2.2 FNC体外抗CVB3机制的初步探索
            2.2.1 FNC体外抗CVB3对病毒、免疫及炎症相关基因表达的影响
                2.2.1.1 引物设计与合成
                2.2.1.2 细胞中总RNA的提取
                2.2.1.3 RNA提取质量检测
                    2.2.1.3.1 RNA纯度检测
                    2.2.1.3.2 RNA完整性检测
                2.2.1.4 RNA反转录
                2.2.1.5 RT-PCR反应
            2.2.2 FNC对CVB3感染的Hela细胞中NF-κB蛋白表达的影响
                2.2.2.1 细胞总蛋白的提取
                2.2.2.2 BCA法测定蛋白浓度
                2.2.2.3 制备聚丙烯酰胺凝胶
                2.2.2.4 上样及电泳
                2.2.2.5 转膜
                2.2.2.6 封闭
                2.2.2.7 孵育一抗
                2.2.2.8 孵育二抗
                2.2.2.9 成像
    3 数据统计分析
    4 实验结果
        4.1 FNC体外抗CVB3药效实验结果
            4.1.1 FNC对Hela细胞毒性结果
            4.1.2 CVB3的病毒滴度结果
            4.1.3 FNC体外抗CVB3活性结果
            4.1.4 FNC体外对CVB3的作用方式
        4.2 FNC体外抗CVB3机制研究结果
            4.2.1 RNA质量检测结果
            4.2.2 FNC体外抗CVB3对病毒、免疫及炎症相关基因表达的影响结果
            4.2.3 FNC对CVB3感染的Hela细胞中NF-κB蛋白表达的影响结果
    5 讨论
    6 小结
第二部分 FNC体内抗柯萨奇病毒B3活性及机制研究
    1 材料与仪器
        1.1 实验病毒
        1.2 实验动物
        1.3 实验药物
        1.4 主要试剂
        1.5 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 FNC体内抗CVB3药效学实验
            2.1.1 建立病VMC小鼠模型
            2.1.2 动物处理
            2.1.3 血清酶活检测
            2.1.4 心脏病理组织检测
        2.2 FNC体内抗CVB3机制的研究
            2.2.1 RT-PCR法检测小鼠脏器中CVB3基因的表达
                2.2.1.1 引物设计与合成
                2.2.1.2 组织中总RNA的提取
                2.2.1.3 反转录及RT-PCR反应
            2.2.2 血清炎症因子的检测
    3 统计学分析
    4 实验结果
        4.1 FNC体内抗CVB3的药效学实验结果
            4.1.1 接种CVB3病毒对Balb/c小鼠状态的影响
            4.1.2 FNC对VMC小鼠血清酶活影响
            4.1.3 心脏病理学检测结果
        4.2 FNC体内抗CVB3机制研究结果
            4.2.1 FNC对VMC小鼠脏器中CVB3基因的影响结果
            4.2.2 FNC对VMC小鼠血清中炎症因子的影响
    5 讨论
    6 小结
全文结论
创新点
展望
参考文献
综述
    参考文献
个人简介
致谢

【参考文献】