化合物TDB对人肝癌SMMC-7721细胞及其裸小鼠移植瘤的抑制作用

发布时间：2020-10-10 19:00

　　 研究目的:肝细胞癌(HCC)有着居高不下的发病率与死亡率,已严重影响人类健康。人们正致力于开发新的肝癌治疗手段或高效低毒的肝癌治疗药物。TDB是一个以苯并恶唑为母体经优化合成得到的新型化合物,前期实验证实TDB对结肠癌、胃癌、肝癌和肾癌细胞的增殖均具有明显的抑制作用。大量的研究表明,肝癌的发生和发展不仅与肝癌细胞分化异常、增殖过度有关,还与细胞凋亡异常相关。PI3K/Akt信号通路在促使肿瘤细胞分化、运动、转移、抑制细胞凋亡以及应对各种应激方面起着关键作用,阻断PI3K/Akt信号通路的过度激活可能是治疗癌症的新途径。因此,本课题以人肝癌SMMC-7721细胞及其裸小鼠移植瘤模型为研究对象,探讨化合物TDB在体内外的抗肿瘤作用及其可能的作用机制,为其开发成抗肿瘤新药提供实验依据。实验方法:1、采用MTT法检测不同浓度TDB处理24 h、48 h、72 h后对SMMC-7721细胞生长的影响。2、采用倒置显微镜观察TDB对SMMC-7721细胞形态的影响。3、采用EdU法检测TDB对SMMC-7721细胞增殖的影响。4、采用流式细胞术检测TDB对SMMC-7721细胞周期的影响。5、采用流式细胞术检测TDB对SMMC-7721胞凋亡的影响。6、采用Hoechst 33258染色法检测TDB对SMMC-7721细胞凋亡的影响。7、采用Western blot法检测TDB对细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响。8、采用IVIS Kinetics小动物活体成像系统检测TDB对裸小鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用。9、采用HE染色法和免疫组化法检测TDB对裸小鼠移植瘤组织细胞凋亡的影响。实验结果:1、MTT法检测结果显示,不同浓度TDB作用于肝癌SMMC-7721细胞24、48、72 h后,能明显抑制细胞生长,且呈现浓度和时间依赖效应。2、倒置显微镜下观察,空白对照组肝癌SMMC-7721细胞呈单层、梭形贴壁旺盛生长,细胞间结构紧密,形态规则,边界清楚。TDB处理组肝癌SMMC-7721细胞,随着浓度的增加,贴壁细胞量减少,细胞间隙变大,细胞体积缩小,部分肝癌细胞出现皱缩、变圆、脱落漂浮于培养基现象。3、EdU法检测结果显示,不同浓度TDB作用于肝癌SMMC-7721细胞能明显抑制肝癌细胞增殖。TDB处理组DNA合成期的细胞比例明显低于空白对照组。4、流式细胞术检测结果显示,TDB能抑制肝癌SMMC-7721细胞进程,明显阻滞细胞于S期。5、流式细胞术检测结果显示,TDB单用能促进肝癌SMMC-7721细胞发生凋亡,且凋亡率呈浓度依赖性上升。TDB联用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002作用于肝癌SMMC-7721细胞后,细胞凋亡率明显上升。6、Hoechst 33258染色法检测结果显示,TDB能诱导肝癌SMMC-7721细胞发生凋亡。7、Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达结果显示,TDB可上调肝癌SMMC-7721细胞的Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达水平,下调Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比值,以上变化呈浓度依赖性趋势。8、Western blot法检测PI3K/Akt通路相关蛋白表达结果显示,TDB能下调p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)蛋白表达水平,抑制PI3K/Akt通路活性。9、裸小鼠肝癌原位移植瘤模型的体内抗肿瘤实验结果显示,TDB具有抑制肝癌移植瘤生长的作用。10、HE染色法和免疫组化法检结果表明,TDB可诱导裸小鼠肝癌组织发生细胞凋亡。结论:化合物TDB对肝癌SMMC-7721细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用,其作用机制可能与TDB抑制PI3K/Akt信号通路的活化,通过线粒体通路下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、上调促凋亡蛋白Bax的表达,激活下游促凋亡效应型蛋白Caspases-3的表达有关。在动物水平,TDB能够抑制肝癌移植瘤的生长,具有体内抗肝肿瘤活性。
【学位单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：

图 1.1 TDB 的化学结构Fig. 1.1 The structure of TDB试生工生物工程（基 美国 美国 美国 H裂解液 碧云天生碧云天生 A (50X) 碧云天生剂盒 碧云天生美国 APBuffer 美国

.4 结果4.1 TDB 对肝癌 SMMC-7721 细胞生长的影响采用 MTT 法检测细胞生长活性，结果如图 1.2 及表 1.1 所示，TDB 在实设浓度 5~20 μg/mL 范围均能抑制肝癌 SMMC-7721 细胞生长。除了 TD/mL 组在 24 h、48 h 时间点 OD 值未见明显变化外（P>0.05），TDB 5 μg 72 h 和 TDB 10、12、15、18、20 μg/mL 各浓度组 24 h、48 h、72 h 的 OD明显下降，与空白对照组比较具有统计学意义（P<0.05 或 P<0.01）。在同测时间内，随着浓度提高，TDB 对肝癌 SMMC-7721 细胞生长抑制作用随强；其作用时间延长，TDB 抑制细胞生长的效果越明显，呈明显的浓度和依赖趋势。经 Graphpad 7.0 软件计算，TDB 对肝癌 SMMC-7721 细胞不同时间 24、48、72 h 的 IC50值分别为 13.8 μg/mL、11.2 μg/mL、7.5 μg/mL。，选取 5、10、15 μg/mL 浓度 TDB 作用于肝癌 SMMC-7721 细胞 48 h，作步研究。

0 1.1408±0.0493 1.0004±0.0689 0.8014±0.0768 - - -5 1.0171±0.0482 0.7362±0.0311 0.5266±0.0763**10.81 24.98 3410 0.8660±0.0608*0.5962±0.0897*0.3736±0.1143**24.13 39.32 5312 0.7470±0.0714*0.5450±0.0750*0.1890±0.0605**34.62 44.63 7615 0.5696±0.0391**0.3466±0.0790*0.1456±0.0347**50.09 64.92 8118 0.2091±0.0301**0.1910±0.0447*0.1080±0.0294**81.70 80.66 8620 0.1334±0.0206**0.1319±0.0089**0.0920±0.0215**88.33 86.58 88注：与空白对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。.4.2 TDB 对肝癌 SMMC-7721 细胞形态的影响采用倒置显微镜进行形态学观察，结果如图 1.3 所示，空白对照组肝MMC-7721 细胞形态正常，呈单层贴壁、旺盛生长，细胞间结构紧密，边界；而 TDB 处理组肝癌细胞生长不良，贴壁量减少，细胞间隙变大，形态变规则。随着药物浓度的升高，部分细胞甚至出现细胞皱缩、变圆、脱落漂培养基现象。
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本文编号：2835456