硫氧还蛋白还原酶小分子抑制剂的发现及抗肿瘤机制探讨

发布时间：2020-10-11 02:35

　　 由硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、硫氧还蛋白(Trx)和NADPH组成的硫氧还蛋白系统是维持生物体氧化还原平衡和基于氧化还原信号通路调节的关键抗氧化系统。越来越多的证据表明硫氧还蛋白系统与人类许多疾病密切相关。哺乳动物TrxR蛋白主要以细胞质TrxR1和线粒体TrxR2两种形式存在,它是含有硒代半胱氨酸(Sec)残基的硒黄素酶。TrxRs催化电子从NADPH转移到Trxs的活性位点进而还原Trxs,而还原态Trxs与下游靶点的相互作用对多种基于氧化还原的细胞内反应进行调控,包括细胞增殖、分化和死亡。恶性肿瘤细胞的硫氧还蛋白水平通常高于正常细胞,靶向Trx/TrxR系统被认为是阻止肿瘤发展和转移的有效方法。因此,近年来人们一直致力于开发针对TrxR的小分子作为癌症的潜在治疗剂。虚拟筛选是应用计算机方法从化学数据库中选择目标化合物的策略,其被广泛应用于从百万数量级的类药分子数据库中挑选出潜在的活性候选化合物,相比较于传统的筛选流程可以显著降低研发成本和时间。而基于结构的虚拟筛选(Structure-Based Virtual Screening,SBVS)适用于受体结构已知的情况,首先化合物与前期选择的目标结合位点进行对接,通过对结合模式进行预测,SBVS将对接分子进行排序,排序将作为选择潜在分子的标准,或者与其他评价方法综合使用,然后对所选择的化合物进行实验评价,进而确定它们对分子靶标的生物活性。本论文运用SBVS策略成功地从天然产物数据库的数十万个分子中发现了新的TrxR抑制剂,该研究充分证明了虚拟筛选策略的高效性和选择性。我们对打分靠前的15个化合物进行了毒活和酶抑制活性测试,测试结果显示化合物6、7、11和12表现出选择性的肿瘤细胞毒活性。而细胞外纯TrxR及细胞内TrxR活性测试发现15种化合物不同程度的对TrxR的活性产生了抑制,特别需要指出的是化合物2、3、6、7、11和12对TrxR表现出强烈的抑制作用。鉴于目标化合物具有结构相似性,我们对化合物2、7和12利用共价分子对接对其结合模式进行分析。结合模式分析表明,抑制剂与TrxR活性位点之间的多种非共价相互作用促进了TrxR上的Sec498与抑制剂上的α,β-不饱和酮之间的共价键的形成,以及与TrxR上的Lys29、R351发生一系列非共价相互作用进而阻碍了TrxR和Trx之间的相互作用。机理分析表明,化合物7通过抑制TrxR导致氧化态Trx的积累和ROS水平的升高,并进一步促进HeLa细胞中氧化应激介导的细胞凋亡。总之,将虚拟筛选运用到开发TrxR抑制剂这一策略可以有助于加速从小分子数据库中筛选出可以作为潜在治疗剂的TrxR抑制剂。基于虚拟筛选的研究策略和筛选化合物结合模式的共价分子对接,我们后期选出类似结构的三种天然产物小分子苍耳亭、鹅掌楸内酯和小豆蔻明进行以硫氧还蛋白还原酶为靶点抗癌机制研究。其中,苍耳亭和鹅掌楸内酯分别是从中传统草药苍耳子和鹅掌楸中分离出来的天然倍半萜内酯,而小豆蔻明侧是从姜科植物草豆蔻的干燥成熟种子中分离出来的查尔酮,三种化合物均已被证明具有潜在的抗癌活性。在本论文中对它们的抗癌机制展开了研究,首先我们证明苍耳亭、鹅掌楸内酯和小豆蔻明均可以有效抑制胞外TrxR以及细胞内TrxR的活性,并且TrxR酶C末端的Sec残基是主要的抑制目标。随后,生物活性实验显示三种天然产物小分子均可以引起细胞内活性氧的产生,进一步促进肿瘤细胞产生氧化应激从而诱导细胞凋亡。总之,我们的结果首次解释了三种天然产物小分子化合物以TrxR为靶点的抗癌作用机制,并为开发潜在的靶向TrxR抑制剂的抗癌药物提供了理论支撑。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R914;R96
【部分图文】：

GSH和Trx系统

图 1-2 硫氧还蛋白系统的底物和主要功能[27]Figure 1-2 The substrates and functions of thioredoxin system. Solid lines indicate thiol-disulfideexchange reactions, and doted lines show direct binding. Oxidative stress promotes Nrf2activation to induce Trx and TrxR expression.Trx1 主要位于胞质溶胶中，它为 RNR 提供电子并催化还原 Prxs[2]和Msrs[28]。在氧化条件下 Trx1 可以转移至细胞核中，并通过调节 NF B、HIF、p53、Nrf2、AP-1 和糖皮质激素受体等转录因子与 DNA 结合来调节基因表达[29-31]。此外，还原态 Trx1 可以直接结合 PTEN，PTEN 是一种通过 PI3K/Akt 通路失活来阻止存活信号的肿瘤抑制因子。与 Trx1 结合抑制了 PTEN 的磷酸酶活性并促进细胞增殖和肿瘤生长，同时也抑制细胞凋亡[32]。Trx 也是凋亡信号调节激酶 ASK1 的重要调节因子，还原态 Trx 可以结合并抑制 ASK1。然而，高水平的 ROS 会促进 Trx 的氧化，因此释放 ASK1 会导致细胞凋亡[33]。Trx 与 TXNIP（人硫氧还蛋白相互作用蛋白）相互作用蛋白也可以促进 ASK1 释放，TXNIP 是 Trx 的内源性抑制剂，其与还原态 Trx 结合并同 ASK1

硫氧还蛋白还原酶分类和催化活性rxRs 是一种二聚体黄素酶，它和谷胱甘肽还原酶同属于吡啶核苷酸二硫还原酶家族[10, 37]。它们有两种存在形式，低分子 TrxRs（大约 35kDa）等真核生物和原核生物中，高分子 TrxRs（约 55kDa）存在于高等真核8, 39]。低分子 TrxRs 含有一个 FAD 和一个氧化还原活性二硫键序列，但于大 TrxR 变体的 C 末端 XCU/CX 活性位点[38, 40]。大多数高分子 Trx乳动物TrxRs）含有XCUX序列的硒代半胱氨酸，含有XCCX序列的Trx现在某些寄生虫和昆虫中。乳动物 TrxR 的主要催化机制已经被广泛研究，其通过酶结合的 FAD 将NADPH 转移至氧化的 N 末端二硫键序列，还原的二硫醇将这些电子与基的 C 末端活性位点中的谷胱甘肽硒基硫醚进行交换，形成还原的硒，从而有助于 Trx 和 DNTB 等大多数底物的还原[41, 42]（图 1-3A）。包含多种底物并不需要完整的 Sec 残基，它们可以通过 N 末端的 C59/C64 列直接进行还原[43]。
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本文编号：2835924