基于高通量筛选的混合模式层析分离人血白蛋白和抗体研究

发布时间：2020-10-11 07:53

　　 人血白蛋白和抗体是两种重要的生物技术药物,市场需求量大。以离子交换层析为代表的传统人血白蛋白分离存在耐盐性差、选择性低等不足,以ProteinA亲和层析为代表的经典抗体分离过程存在介质成本高、洗脱和再生困难等局限,开发新型分离方法具有重要意义。混合模式层析(MMC)具有吸附容量高、耐盐性好、选择性强等优势,适用于复杂料液的直接分离;高通量过程开发(HTPD)可快速、高效地筛选介质和优化分离条件,提高过程开发效率;示差扫描荧光法(DSF)可用于考察小分子配基和蛋白间的亲和性,提高配基筛选效率。本文围绕MMC,以重组人血白蛋白(rHSA)和人免疫球蛋白(hIgG)为分离目标,引入HTPD和DSF,实现蛋白层析分离的高通量过程开发,探讨新技术在人血白蛋白和抗体分离中的应用。首先,建立了基于微孔过滤板的HTPD方法,优化了操作参数,考察了两种离子交换介质和四种MMC介质对人血白蛋白的吸附和洗脱性能,并进行层析分离验证。结果显示,对于阴离子交换型介质Q Sepharose FF和Capto adhere,pH 8.5和pH 5.5适合于HSA吸附,洗脱条件为pH 4.0;对于阳离子交换型介质SP Sepharose FF、Capto MMC、MX-Trp-650M 和 NuviacPrime,最佳上样条件为 pH 4.0,洗脱条件分别为pH 7.0、pH8.0和pH 9.0。在优化的分离条件下,柱层析与高通量筛选结果相一致,六种介质均有较高的动态结合载量DBC10%和大于95%的洗脱收率。其次,以毕赤酵母发酵液中分离rHSA为目标,采用HTPD方法,考察了两种离子交换介质和四种MMC介质的吸附选择性和洗脱性能。发现阳离子交换型介质的吸附容量和选择性均明显优于阴离子交换型介质,尤其是MMC介质Capto MMC和MX-Trp-650M。洗脱优化结果显示,MX-Trp-650M介质的洗脱条件温和,收率和纯度高。进一步柱层析结果表明,MX-Trp-650M介质的吸附容量大、耐盐性强、选择性好、洗脱温和、宿主细胞蛋白和色素去除能力强。在最佳上样pH 4.0、不稀释料液条件下,DBC10%为49.8 mg/mL,pH 8.0洗脱收率为97.1%,纯度为 97.0%,HCP 为 581 ppm,A350/A280为0.12。将层析柱 MX-Trp-650M介质体积放大20倍,分离效果与1 mL层析柱一致,收率为94.8%,纯度为95.9%,HCP含量为415ppm。建立了 DSF方法用于蛋白分离配基筛选,发现荧光染料SYPRO Orange无法用于人血白蛋白,但可以用于IgG,并优化了 DSF条件。针对人免疫球蛋白hIgG和单克隆抗体(mAb),选择33个小分子为潜在的MMC配基,采用DSF方法探讨了配基与hIgG和mAb的亲和性。结果发现,对于课题组前期研发的三种配基,ABI亲和力最强,其次为MEP,MMI最弱。以MMI的△Tm为低亲和性指标,MEP为一般亲和性指标,ABI为高亲和性指标,分析了其它分子对抗体的亲和性,考察了 pH和盐浓度的影响。发现不加盐时,在pH 5.0-8.0范围内,随着pH升高,熔融温度差△Tm先增大后减小;加盐后,△Tm基本保持不变,显示出较好的耐盐吸附性。经比较分析,发现六个小分子(PCA、6-ABT、BPA、BIA、IAAH和SFA)对hIgG和mAb的亲和性都较高,处于ABI和MEP之间,具有抗体高效结合的潜力。以琼脂糖凝胶为基质,偶联DSF筛选得到的PCA、6-ABT、BPA、BIA、IAAH和SFA配基,制备六种MMC新介质,考察了 hIgG和pHSA的吸附能力,并与MEP和ABI介质比较。发现BPA-B-6FF和SFA-B-6FF介质的hIgG吸附容量大,耐盐性强,选择性高。pH 7.4和流速102 cm/h下,ABI-B-6FF动态载量高,耐盐性强,但选择性一般;BPA-B-6FF动态载量和选择性均较高,但耐盐性差,需在低电导率下捕获抗体;SFA-B-6FF动态载量和选择性均较高,耐盐性适中,可在较广的电导率下捕获抗体。SFA-B-6FF用于人血清中分离抗体,抗体纯度达99.1%,hIgG纯度为87.5%;若血清稀释4倍,抗体和hIgG纯度保持不变,收率增大到83.8%。结果表明,SFA-B-6FF介质对hIgG选择性好,pH洗脱范围广,耐盐性适中,具有从血清中特异性分离免疫球蛋白的能力。本文围绕MMC分离新方法,采用HTPD筛选了人血白蛋白分离的合适介质和分离条件,并利用DSF筛选了抗体分离的合适配基,制备了新型MMC介质,探讨了 rHSA和hIgG分离新过程,实现了实际料液的高效分离纯化,为MMC应用打下了良好基础。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R914
【部分图文】：

１＿２．１人血白蛋白的结构与功能??ＨＳＡ含有５８５个氨基酸残基，分子量６６．５ｋＤａ气等电点约４．７Ｗ２５，约占血浆总蛋白??的６０?％左右＾ＨＳＡ在肝脏中合成，以非糖基化单链形式输出。ＨＳＡ结构见图１．１，约??６７％为ｃｘ螺旋，由三种同源结构域组成（Ｉ、１丨、ｍ），不同结构域之间通过末端无规卷曲??相连２７。每个结构域由两个独立、螺旋的子域组成（Ａ和Ｂ），分别包含四个和六个ａ螺??旋，通过脯氨酸残基形成的柔性环或者域间二硫键，子域相对于彼此移动，改变分子的空??２??

发挥免疫功能＇人血液中含有五种免疫球蛋白ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ和ＩｇＥ，其中ＩｇＧ??含量最高，约占血漀蛋白的Ｈ）？２０?％气??ＩｇＧ结构如图１．２所示，呈“Ｙ”型，分子量约为１５０ｋＤａ，由两条５０ｋＤａ的丫型重??５??

疏水相互作用层析（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，?ＨＩＣ）或羟基鱗灰石层析??（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，?ＨＡＣ）等两种层析组合实现抗体的精制分离。??典型的抗体分离流程如图１．３所示，包括抗体捕获和纯化精制两个阶段。分离纯化过??程中，需要关注过程相关杂质（如宿主细胞蛋白水平、ＤＮＡ含量、内毒素、ＰｒｏｔｅｉｎＡ泄??漏和细胞培养添加剂）、产品相关杂质（抗体聚集体和片段）以及病毒去除率等７气??（１）抗体捕获??Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ公司７４?７５的研究人员采用Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａ亲和层析从动物细胞培养液中捕获??ｍＡｂ。以ＣＨＯ细胞作为表达体系，ｍＡｂ分泌到细胞培养液，具体捕获步骤如下：（Ｉ）??料液预处理。采用离心方式去除ＣＨＯ细胞和碎片，控制过滤膜孔径和流量，通过深层过??滤（Ｄｅｐｔｈｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）去除部分宿主细胞蛋白（ＨＣＰｓ）。（ＩＩ）?ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和层析捕获。??８??
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本文编号：2836305