度拉糖肽对AD样小鼠学习记忆的保护作用及其机制

发布时间：2020-10-11 12:47

　　 目的:通过腹腔和脑室注射两种不同给药方式探究度拉糖肽对散发型和转基因AD模型小鼠对学习记忆的保护作用及其机制。方法:(1)SPF级9周龄雄性野生型C57/BL6小鼠随机分为野生对照组(CON),模型组(STZ),度拉糖肽治疗组(Dul)和抑制剂组(Ex),每组10只。造模前小鼠适应实验室环境一周,之后对STZ组、Dul组和Ex组小鼠进行两次双侧脑室重复注射STZ(3 mg/kg)建立散发型AD模型,三周成模后对Dul组小鼠每周腹腔注射度拉糖肽(12μmol/kg,无菌生理盐水稀释),Ex组小鼠每周给予度拉糖肽(12μmol/kg)和Ex9-39(0.8 g/kg),连续给药4周。CON组和STZ组小鼠每天腹腔注射与处理组相同体积无菌生理盐水。小鼠的体重每周监测一次并做记录,并分别记录监测小鼠在造模前、治疗前和处死前的血糖水平,Morris水迷宫实验通过行为学方法用来评价小鼠的空间学习记忆能力,分别用蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验检测小鼠脑组织内的Tau蛋白和神经丝(NFs)及其磷酸化水平,蛋白免疫印迹实验检测突触相关蛋白、Aβ、GLP-1和GLP-1R的表达水平和PI3K、AKT、GSK3β、CREB的磷酸化水平,尼氏染色标记小鼠脑组织内尼氏小体的变化和高尔基染色标记小鼠大脑皮层神经元细胞和突起。(2)SPF级9周龄雄性野生型C57/BL6小鼠和APP/PS1/Tau三重转基因(3×Tg)小鼠采取随机分组的方法进行分组。野生型C57/BL6小鼠分为野生对照组(CON)、模型组(STZ)、低剂量度拉糖肽组(Dul(L),4μmol/kg)、高剂量度拉糖肽组(Dul(H),12μmol/kg)、低剂量度拉糖肽+抑制剂组(Dul(L)+Ex,4μmol/kg+0.8 g/kg)、高剂量度拉糖肽+抑制剂组(Dul(H)+Ex,12μmol/kg+0.8g/kg)和抑制剂组(0.8 g/kg),每组10只。除CON组外其余各组均进行两次重复双侧脑室注射STZ(3 mg/kg)建立散发型AD模型,三周成模后对各组小鼠按剂量每周脑室注射一次,每次处理时CON组小鼠均进行相同体积的无菌生理盐水的脑室注射。3×Tg小鼠随机分为野生对照组(CON),转基因对照组(Tg),度拉糖肽组(Dul,4μmol/kg),度拉糖肽+抑制剂组(Dul+Ex,4μmol/kg+0.4g/kg)和抑制剂组(Ex,0.4 g/kg),脑室注射每周一次,CON组小鼠注射等体积的无菌生理盐水。以上实验均持续4周。每周监测记录小鼠的体重,并分别记录小鼠在造模前、治疗前和处死前的血糖,转基因组小鼠除记录小鼠的体重外,并且记录在实验开始前和处死前小鼠的血糖,利用水迷宫实验评价小鼠的学习记忆能力,免疫印迹检测小鼠脑内Tau蛋白和NFs及其磷酸化水平、突触蛋白的表达水平、PI3K、AKT和GSK3β的磷酸化水平以及通路蛋白GSK3β的磷酸化水平。尼氏染色标记小鼠脑组织内尼氏小体的变化和高尔基染色标记小鼠大脑皮层神经元细胞和突起。结果:(1)散发型AD小鼠在各组之间血糖无明显差异。Dul组小鼠的体重比STZ组下降,其他各组之间体重没有明显差异,无统计学意义。与CON组相比,STZ组小鼠的游泳距离、逃避潜伏期明显较长,在目的象限的时间和穿越平台的次数明显较少,Tau蛋白和神经丝的磷酸化水平高,Aβ的聚积较多,CREB磷酸化水平降低,GLP-1和GLP-1R的表达量较少,突触的长度和分支都相对减小,突触的可塑性下降。度拉糖肽治疗后上述指标均得到改善,小鼠表现出学习记忆的改善,AD样的病理变化都有了一定程度的好转,加入抑制剂后各项指标有不同程度的减弱或损伤,小鼠的学习记忆能力与Dul组相比下降,各项病理指标都较Dul组小鼠加重。(2)脑室注射度拉糖肽处理后在STZ诱导的散发型AD小鼠组中发现体重有所下降,高剂量度拉糖肽较低低剂量度拉糖肽在改善小鼠的学习记忆、降低Tau蛋白和神经丝的磷酸化、增加突触的表达量以及增加尼氏小体的数量、促进突触的再生都有明显的作用,加入抑制剂后,小鼠的学习记忆能力下降,Tau蛋白和神经丝的磷酸化水平升高,突触的表达水平降低,突触的可塑性下降,尼氏小体的数量也下降,AD样的病变较单独给药组改善不明显。在AD模型小鼠基础上继续给抑制剂,小鼠AD样病变加重。在转基因小鼠中脑室注射度拉糖肽治疗后,游泳距离和逃避潜伏期明显缩短,穿越平台的次数增加,Tau蛋白和神经丝的磷酸化明显减少,突触蛋白表达水平和突触的长度和数量以及神经生长因子CREB都有不同程度的改善,加入抑制剂后以上指标都有所下降或减少。结论:度拉糖肽通过减少Tau和神经丝的磷酸化,促进突触的表达,修复糖代谢通路的损伤进而改善AD样的病理变化。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：

数据无统计学意义。1.2.1.2 小鼠血糖的结果结果如图1 B所示，从开始造模前即第0天检测并记录各组小鼠的血糖水平，之后分别在开始治疗前即第 3 周和处死前即第 7 周分别记录各组小鼠的血糖数据。根据测得的结果各组小鼠之间的血糖水平无显著性差异。图 1 小鼠体重和血糖的结果A 小鼠体重的变化（与 STZ 组相比，*P < 0.05）；B 小鼠血糖的变化1.2.2 散发型 AD 小鼠的 Morris 水迷宫实验结果1.2.2.1 定位航行实验结果定位航行实验中，各组小鼠的游泳距离随着训练次数的增加逐渐缩短，小鼠更容易确定平台位置。小鼠的逃避潜伏期在实验中也呈现相同的趋势，从一开始漫无目的的寻找到直线式的变化，小鼠逐渐形成对隐匿平台在水迷宫中的方位和位置的记忆。在训练的前两天，各组小鼠的逃避潜伏期变化差异不明显。多次重复训练后

19图 3 小鼠脑组织中 Tau 蛋白蛋白免疫印迹和免疫荧光结果A 各组小鼠脑组织 Western Blotting 图；B 磷酸化的 Tau 蛋白位点统计图；C 小鼠脑组织 Tau 蛋白 Ser199/202 位点的磷酸化免疫荧光结果（放大倍率 40X）(与CON 组相比，**P < 0.01；与 STZ 组相比，##P < 0.01)1.2.4 散发型 AD 小鼠脑组织中 NFs 蛋白的磷酸化水平1.2.4.1 小鼠脑组织 NFs 蛋白 Western Blotting 结果神经丝是构成神经元细胞骨架的主要成分。以 R61d 抗体检测总 NF-H（重链）和 NF-M（中链）作为内参，SMI31 抗体检测小鼠脑组织神经丝蛋白 NF-H和 NF-M 磷酸化水平。结果如图 4 所示，与 CON 组相比，STZ 组小鼠的神经丝磷酸化水平升高，与 STZ 组相比，Dul 组小鼠脑组织的神经丝磷酸化水平降低。加入抑制剂后，Ex 组小鼠的神经丝磷酸化水平比 Dul 组又有升高,与 STZ 组小鼠的磷酸化水平无明显差异。实验结果提示 AD 样小鼠脑内神经丝的过度磷酸化经度拉糖肽治疗后得到改善。

图 4 小鼠脑组织中 NFs 蛋白免疫印迹和免疫荧光结果A 各组小鼠脑组织神经丝蛋白 Western Blotting 结果；B 磷酸化的神经丝蛋白水平统计图；C 小鼠脑组织神经丝蛋白 NF-H/M 磷酸化免疫荧光结果（放大倍率40X）(与 CON 组相比，*P < 0.05；与 STZ 组相比，#P < 0.05)1.2.4.2 各组小鼠脑组织中神经丝蛋白的免疫荧光结果结果显示，NFM 抗体标记神经丝总蛋白，SMI31 抗体标记 NF-H/M 蛋白磷酸化蛋白，DAPI 标记细胞核，进一步研究各组小鼠脑组织中神经丝蛋白的磷酸化水平的改变。图 4 C 中可见 NFM 抗体标记的皮质区域显示各组总神经丝表达无明显差别；SMI31 抗体标记的皮质区域显示，STZ 组的神经丝磷酸化水平明显大于 CON 组和 Dul 组，Ex 组的神经丝磷酸化水平比 Dul 组高，与 STZ 组的神经丝磷酸化水平都较 CON 组和 Dul 组小鼠高（图 4 C），说明度拉糖肽能够缓解散发型 AD 样的病理改变，使脑组织神经丝蛋白的过度磷酸化水平降低。1.2.5 散发型 AD 小鼠脑组织中神经突触蛋白的表达水平β-actin 作为内参，实验用 SAP97 抗体和 SP11 抗体分别检测突触相关蛋白
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本文编号：2836610