青稞β-葡聚糖的制备、结构解析及其降血脂活性的研究

发布时间：2020-10-21 09:22

　　 研究背景:青稞,作为一种高原谷物,是青藏高原高寒农业区的主要粮食作物,其β-葡聚糖含量高于其他各类谷物。β-葡聚糖是一种可溶性膳食纤维,由吡喃型葡萄糖通过β-(1→3)以及β-(1→4)糖苷键交替连接而成。据文献报道谷物中的β-葡聚糖拥有良好的降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化甚至是抗肿瘤的作用。近年来,随着生活水平的提高,高血脂及其引发的心血管疾病的发病率不断上升,严重威胁着人们的身体健康。作为一种天然多糖,β-葡聚糖具备良好降血脂活性,且主要来源于人们日常生活中的主食,安全性能高,毒副作用极少,存在巨大的开发价值,是一种亟待开发的理想药品或保健品资源。然而,当前β-葡聚糖的提取工艺繁琐,产品纯度不高,产率较低,序列解析较难是限制其应用推广的主要原因。此外,β-葡聚糖降血脂活性的作用机制尚不明确,是限制其临床推广的另一大瓶颈。目的:(1)通过参数的优化,确立一套流程简单、产率合适且纯度较高的制备工艺;(2)建立一个迅速、灵敏的分离分析方法对该工艺条件下制备所得青稞β-葡聚糖结构及其寡糖结构进行有效分析;(3)对该工艺条件下制备所得的青稞β-葡聚糖的降血脂活性及其作用机制进行初步探索,为青稞β-葡聚糖在临床上应用的推广提供依据。方法:(1)采用单糖组成分析法对制备过程中杂质多糖进行监测,优化流程中沉淀剂浓度,完善工艺条件;(2)采用硫酸苯酚法测定样品中总糖含量,采用核磁共振法确定样品构型,通过单糖组成分析、总糖含量测定以及核磁共振分析对该工艺条件下制备所得样品进行较为全面的鉴定;(3)采用高效葡聚糖凝胶色谱串联多角度激光散射-示差检测器(SEC-MALLS-RI)对该工艺条件下制备得到的青稞β-葡聚糖分子量分布进行分析;(4)建立一个简单、灵敏并且高效的分离分析方法,将HPAEC-PAD与Q-TOF串联,对青稞β-葡聚糖及酶解其寡糖进行序列解析;(5)建立合适体外模型,对青稞β-葡聚糖体外胆酸结合能力进行测定;(6)通过体内动物实验,进一步确认青稞β-葡聚糖降血脂作用,并通过western blot分析方法对其可能机制进行研究。结果:(1)实验发现,沉淀剂硫酸铵溶液的浓度是最终产物葡聚糖的产率和纯度的主要影响因素。硫酸铵溶液浓度越大,产率越高,但纯度越低。综合考虑产率以及纯度的两方面因素,最终确认制备工艺中采用25%硫酸铵溶液作为沉淀剂最佳,该工艺条件下产物中主要单糖组成为葡萄糖,产率为2.8%。(2)硫酸苯酚法测定提取产物中总糖含量≥99.6%,蛋白等杂质的含量极低;13C-NMR结果进一步确认了产物中葡聚糖均为β型葡聚糖,无α-型葡聚糖的存在,此结果进一步确认该工艺的可行性。(3)通过SEC-MALLS-RI对产物的分子量分布分析,可得青稞β-葡聚糖分子量范围为794796.2 Da(±4.7%),分散系数Mw/Mn 2.445(±6.772%),分子量较大且分布较为集中。(4)创新性地将HPAEC-PAD与Q-TOF串联应用于青稞β-葡聚糖寡糖序列解析,所得EIC谱图与PAD谱图中各峰位的归属结果相互对应,该方法高效迅速地对β-葡聚糖寡糖进行了有效的分离与分析。(5)HPAEC-PAD-MS/MS的结果显示,青稞β-葡聚糖酶解后寡糖分布存在一定特点,若各寡糖聚合度分别用dp3n,dp3n+1,dp3n+2表示,则dp3n一般存在两种序列连接方式,分别表示为[Glc1→4Glc1→4Glc]n和[Glc1→3Glc1→4Glc]n;dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖,其连接方式可表示为[Glc1→3Glc1→4Glc]n1→4Glc;而dp3n+2的寡糖含量相对较少,它一般由均一的β-(1→4)糖苷键连接而成。(6)通过体外降血脂活性评价实验,确认β-葡聚糖存在一定的胆酸结合能力,且随着葡聚糖浓度的增加,其胆酸结合率越高。(7)通过体内降血脂活性评价实验,进一步确认青稞β-葡聚糖的降血脂作用,青稞β-葡聚糖可显著降低小鼠体内TC、TG以及LDL-C水平,适当增加小鼠体内HDL-C水平,此外β-葡聚糖还可通过增加小鼠体内GSH-Px以及SOD抗氧化酶的活性,降低MDA水平,通过抗氧化方式达到对机体的保护作用。(8)综合体外降血脂活性评价实验结果以及western blot结果可初步确认β-葡聚糖的降血脂机制。Western blot结果显示β-葡聚糖可上调CYP7A1蛋白的表达,而上述体外实验表明β-葡聚糖可与胆酸发生有效的结合。由此可知,β-葡聚糖通过增加胆酸的排泄,上调限速酶CYP7A1的表达,促进肝脏中胆固醇代谢为胆汁酸这一过程,并最终达到降低胆固醇及LDL-C水平的目的。结论:本课题成功确立了一套青稞β-葡聚糖的提取纯化工艺,该方法制备的青稞β-葡聚糖具有纯度高、产率高的特点并拥有良好降血脂活性;同时建立了有效的β-葡聚糖结构解析的方法,对青稞β-葡聚糖分子量分布以及糖链上寡糖分布特征进行有效评估,其中值得注意的是,HPAEC-PAD-MS/MS方法具有简便、快速、灵敏、高效等优点;本课题还探讨了该工艺条件下制备所得的青稞β-葡聚糖的降血脂活性,并从蛋白水平探索可能的作用机制,确认β-葡聚糖可通过促进胆酸的排泄,上调CYP7A1蛋白的表达,促进胆固醇代谢为胆汁酸这一过程,最终达到降低血脂的目的。药食同源逐渐成为人们关注的焦点,该实验一方面可为今后的新药研发、生产或质量控制等提供科学依据;另一方面由于β-葡聚糖广泛存在各类食物(如青稞、燕麦等)中,通过增加该类粮作物的摄入,可有效预防或控制高血脂的发生和发展,该实验结果可为今后人们日常饮食提供有力参考。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R943;R96
【部分图文】：

测确定化合物分子量。其中，MALLs 是指十八角度激光散射仪，Wyatt 总结实验结果之间的关系，并确定散射光与分子量、浓度以及折射率增量的平方当溶液折射率、浓度以及散射光已知的情况，便可以有效求出溶液中样品分，见图 6。因此多角度激光散射仪通过对散射光的检测，可快速准确地对任物质进行分子量分布分析，无需任何标准品作参照。综上所述，其中 SEC 可将混合物中不同分子量范围的物质进行有效分离，脱下来的不同成分进行有效的浓度检测，MALLS 可对各洗脱成分的分子量[61]，因而 SEC-MALLS-RI 可对溶液中各洗脱成分的分子量分布进行快速有。当前，该方法已广泛用于肝素、舒洛地特等多糖的分子测定，简单、迅速4.1.2 分子量测定结果该课题采用体积排阻色谱法串联多角度激光光散射检测器-示差折光检测器C-MALLS-RI)对制备所得样品进行分子量的测定，具体结果如图 7：

糖的制备、结构解析及其降血脂活性的研究 第三章 青稞 β-葡聚量分布较为集中，主要以一个片段的形式分布。实验过程中，dn/dc RA软件分析，计算得青稞 β-葡聚糖分子量分布范围为 794796.2 D Mw/Mn 2.445 (±6.772%)。可知，采用该工艺制备得到的 β-葡聚糖分子量约为 800kDa，分子较为集中，说明制备过程中，β-葡聚糖未发生显著降解作用，糖链 β-葡聚糖序列结构解析，HPAEC-PAD 可提供高效的分离作用以及灵敏的检测作用，但是品的对照才可实现峰的归属，极大限制其应用，而质谱可快速、灵的结构、序列方面的信息，该课题的创新性就在于将 HPAEC-PAD对 β-葡聚糖寡糖的有效的序列解析，具体流程见图 8。.1 β-葡聚糖寡糖的分离分析

糖的制备、结构解析及其降血脂活性的研究 第三章 青稞 β-葡聚量分布较为集中，主要以一个片段的形式分布。实验过程中，dn/dc RA软件分析，计算得青稞 β-葡聚糖分子量分布范围为 794796.2 D Mw/Mn 2.445 (±6.772%)。可知，采用该工艺制备得到的 β-葡聚糖分子量约为 800kDa，分子较为集中，说明制备过程中，β-葡聚糖未发生显著降解作用，糖链 β-葡聚糖序列结构解析，HPAEC-PAD 可提供高效的分离作用以及灵敏的检测作用，但是品的对照才可实现峰的归属，极大限制其应用，而质谱可快速、灵的结构、序列方面的信息，该课题的创新性就在于将 HPAEC-PAD对 β-葡聚糖寡糖的有效的序列解析，具体流程见图 8。.1 β-葡聚糖寡糖的分离分析
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本文编号：2849939