新型PPARγ激动剂CMHX008对高脂诱发糖尿病肾损伤的改善作用和机制研究

发布时间：2020-10-21 12:59

　　 前言:经典的噻唑烷二酮类药物如罗格列酮(Rosi)作为治疗二型糖尿病的常用药物,由于其常伴有较多甚至严重的不良反应而限制了其在临床的使用。因此,我们前期研究合成了激动PPARγ能力较弱的CMHX008,前期发现其具有与Rosi相似的胰岛素增敏作用的同时对心脏、骨骼、体重较Rosi显示出更好的安全性。糖尿病肾病为糖尿病的主要并发症之一,据文献报道,Rosi对糖尿病肾病显示出抗纤维化作用,但CMHX008对糖尿病肾病的影响并不清楚。本研究旨在以Rosi为对照,探讨新型PPARγ激动剂CMHX008(C)对糖尿病肾病的影响及机制。方法:采用高脂饮食诱发的2型糖尿病小鼠为模型,随机分为:高脂空白组(HV组)、罗格列酮组(HR组)、CMHX008组(HC组),低脂喂养的小鼠给予等量溶媒作为低脂空白组(LV组)。收集各组小鼠尿液及血清行全自动生化分析检测,HE染色观察肾脏组织形态,天狼星红和Masson染色显示肾脏组织的胶原纤维存积,RT-PCR检测α-平滑肌肌动蛋白、E-钙粘蛋白、I型胶原纤维及纤连蛋白mRNA在肾脏的相对表达量;Rosi和C处理30mM/L葡萄糖条件下培养的HK-2细胞,采用CCK-8法检测不同药物浓度处理后各组HK-2细胞的存活率,免疫印迹法检测纤维化标志蛋白和磷酸化PPARγ(ser273)的表达,qRT-PCR检测纤维化标志物mRNA的表达,划痕和Transwell实验检测不同处理组HK-2细胞的迁移和侵袭能力。结果:HR组和HC组的尿蛋白/肌酐比值(Upro/Cr)较HV组减少,HC组血清中的尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)浓度显著减少,提示CMHX008和罗格列酮对肥胖小鼠肾脏功能损伤有改善作用;苏木精-伊红(HE)染色表明,与HV组相比,HR和HC组肾小管损伤明显改善;天狼星红及Masson染色显示HR组及HC组肾脏的纤维化存积较HV组明显减少;RT-PCR结果显示,与HV组比较,HR组、HC组间充质标志物α-SMA、Collagen I、Fibronectin mRNA表达显著下调,上皮细胞标志物E-cad mRNA表达显著上调;从细胞实验CCK-8法的结果中发现3μmol/L Rosi和3μmol/L C均对HK-2细胞无明显细胞毒性,免疫印迹法显示给与Rosi和C能逆转高糖条件下PPARγser273位点磷酸化的上调,减少TGF-β1、α-SMA的表达,增加E-cad的表达,划痕和Transwell实验显示Rosi和C改善高糖引起HK-2细胞迁移和侵袭能力的增强。结论:与Rosi类似,新型PPARγ激动剂C能改善小鼠糖尿病引起的肾功能减弱,抑制长期高脂诱导的糖尿病小鼠肾脏的纤维化和高糖引起的人肾小管上皮细胞纤维化标志物的上调,提示CMHX008有改善糖尿病引起的肾脏纤维化的作用,其机制可能与抑制PPARγ丝氨酸273位点的磷酸化有关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：

通过对罗格列酮的结构进行改造，我们合成了新型 TZDs 类 PPARγ激动剂CMHX008（Fig 1）,其对 PPARγ的激动能力较罗格列酮弱，但具有与罗格列酮相似的胰岛素增敏和促进脂肪细胞分化的作用[18]。Choi 等研究表明在高脂条件下，脂肪细胞中 CDK5 介导的 PPARγ的磷酸化明显增加，抗糖尿病药物罗格列酮通过抑制脂肪细胞中 CDK5 介导的 PPARγSer273 位点的磷酸化来增加胰岛素对葡萄糖的敏感性，进而发挥体内维持正常葡萄糖水平的作用[19]。通过研究发现，CMHX008可以抑制肥胖小鼠脂肪组织中 PPARγSer273 位点的磷酸化，对骨量丢失的程度较罗格列酮明显减轻[20]。那么，在糖尿病肾病中，PPARγ部分激动剂 CMHX008 对肾脏功能的改善是否与 PPARγSer273 位点磷酸化有关。因此，本研究旨将以传统胰岛素增敏药物罗格列酮作为阳性对照，采用高脂诱导的肥胖小鼠模型和高糖诱导的人肾小管上皮 HK-2 细胞为模型进行研究,阐明 CMHX008 是否能够改善 2 型糖尿病引起的肾脏功能减弱，减弱肾脏纤维化的发生，以及糖尿病肾病的改善作用与 ser273 位点 PPARγ的磷酸化的关系。

分析检测结果显示（Tab 2），与 LV 组比较，HV 组小鼠尿液 Na+浓度明显降低；与 HV 组比较，HR 组 Na+浓度无明显改善，HC 组 Na+浓度明显增加。肾损伤通常是无症的，由蛋白尿、血尿或者肾小球滤过率 GFR 的减少表示[5]。Tab 2、3 结果表明，与 LV 组比较，HV 组小鼠 Upro 浓度、Upro/Cr 比值、Scr 浓度明显上升，表明长期高脂饮食喂养会影响小鼠肾脏对 Upro、Scr 的排泄，造成肾脏的损伤。通过 16 周的长期给药，与 HV 组比较，HR 组、HC 组 Upro 浓度减少约 40%、50%；HR、HC 组 Upro/Cr 比值均减少约 50%（Tab 3）。分析小鼠血清各指标结果显示（Tab 4），与 HV 组比较，HR 组 Scr 浓度明显增加，而 BUN 的浓度较 HV 组差异无显著性；HC 组 BUN、Scr 浓度明显减少，表明 CMHX008 较罗格列酮能更加有效降低血清中尿素氮、血肌酐水平。结果表明，罗格列酮和CMHX008 对高脂诱发的 2 型糖尿病小鼠肾功能受损有改善作用，CMHX008 较罗格列酮改善更为明显。

图 3 肾脏 H&E、天狼星红染色及 Masson 染色(X400)。LV:低脂空白组；HV：高脂空白组；HR：罗格列酮组；HC：CMHX008 组。Fig 3 H&E, Sirius red and Masson’s trichrome staining of kidney tissues (×400). LV：lowfat-diet group; HV: high fat-diet group; HR: rosiglitazone group; HC: CMHX008 group.2.3 罗格列酮和 CMHX008 对肾脏纤维化改善作用可能与肾小管上皮细胞表型转化的减弱有关检测肾脏组织中相关分子 mRNA 相对表达量发现（Fig 4A-D），与 LV 组比较，HV 组间基质α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I 型胶原纤维（Collagen I）、纤连蛋白（Fibronectin，FN）mRNA 表达明显上调，上皮标志蛋白 E-钙蛋白（E-cadherin，E-Cad）mRNA 表达明显下调；与 HV 组比较，HR组α-SMA、Collagen I、Fibronectin mRNA 的表达明显下调，E-cad mRNA 表达明显上调，HC 组α-SMA、Collagen I、Fibronectin mRNA 表达明显下调，E-cad mRNA
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本文编号：2850145