研究背景人口老龄化已成为严峻的社会问题。全国老龄工作委员会办公室公布的统计数据显示,我国目前60岁以上人口已达总人口的]7.3%,预计至2050年前后,老龄人口的总量将会突破4.87亿,达到总人口的34.7%。伴随着老龄化的进程,老年人群心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病的发病率明显增加,导致健康预期寿命缩短。同时,与年龄相关的慢性疾病如2型糖尿病、骨性关节炎、血管性痴呆等严重影响老年人的生活质量,进一步增加了社会负担。因此,研究衰老发生的具体机制,探讨有效延缓衰老的治疗策略,具有积极的社会意义。但截至目前,关于衰老的具体发病机制仍不明确,现有的抗衰老治疗策略远未达到预期效果,亟需进一步深入研究。衰老是复杂的生物学现象。目前的研究认为,个体衰老与细胞衰老存在紧密的联系,是细胞衰老累积的结果。细胞衰老不同于细胞凋亡,细胞发生衰老后可长期存活,并出现一系列的细胞衰老表型改变。2008年,Coppe JP等首次提出了细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)的概念。SASP是衰老细胞分泌各类细胞因子功能增强的表型。细胞衰老后可分泌大量的炎性因子、趋化因子、基质金属蛋白酶等,不同的SASP因子介导衰老细胞在体内发挥不同的生理作用。具有促炎作用的SASP因子,可影响细胞周围的微环境,导致组织器官发生炎性改变。伴随年龄增长,衰老细胞发生累积,导致SASP因子持续分泌,诱发机体形成慢性持续性炎症,参与糖脂代谢异常、冠状动脉粥样硬化、血管性痴呆、恶性肿瘤等疾病的病理过程。因此,针对衰老相关的慢性炎症进行干预,可能是延缓衰老发生发展、控制衰老相关性疾病的有效措施。脂肪组织可分泌脂肪因子、炎性因子等调节全身能量代谢与慢性炎症,是重要的内分泌器官。衰老脂肪组织功能紊乱是老年人群2型糖尿病等代谢性疾病发病率增加与机体衰弱的主要原因,在衰老的发生发展过程中占据重要地位。衰老脂肪细胞分泌脂肪因子、炎性因子、基质金属蛋白酶等细胞因子的功能增强,形成脂肪组织SASP,SASP因子逐渐积累,导致脂肪组织处于持续性慢性低度炎症状态,脂肪组织功能发生紊乱,干扰胰岛素代谢,并引起全身代谢功能异常,促发胰岛素抵抗及代谢综合征。同时,脂肪组织衰老后还会募集大量免疫细胞浸润到衰老的脂肪组织,尤其是CD3+T细胞、CD4+T细胞与调节性T细胞比例显著增高,与SASP因子一起加重脂肪组织炎症并维持脂肪组织长期处于慢性炎症状态。因此,采取有效措施抑制脂肪组织SASP及慢性炎症,是改善脂肪组织功能紊乱,降低衰老相关代谢性疾病发生的关键环节。研究发现,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)/p53信号通路是SASP调控的关键环节。JNK是丝裂原激活蛋白激酶家族重要成员,在人类细胞的增殖、分化、凋亡等生物学反应中发挥调控作用。p53是JNK信号通路下游分子,参与调节细胞的凋亡、衰老过程。JNK/p53信号通路功能失调可导致SASP异常活化,与机体慢性炎症、糖尿病、肿瘤的发生发展存在紧密联系。JNK激活可上调p53的表达,p53活化后介导细胞周期停滞,导致细胞衰老,诱导SASP因子分泌。细胞周期的停滞又可激活JNK信号通路形成正反馈,放大SASP因子分泌效应。但截至目前,仍缺乏针对JNK/p53信号通路的有效干预措施。左卡尼汀又称左旋肉毒碱,是哺乳动物体内普遍存在的类维生素样的天然物质,其生理功能是协助长链脂肪酸进入线粒体参加氧化磷酸化。有研究发现,左卡尼汀对JNK及p53均有抑制作用,可减轻JNK/p53信号通路介导的炎性反应,改善慢性炎症状态。基于以上的研究基础,我们推测应用左卡尼汀干预,通过抑制JNK/p53信号通路,可以抑制衰老大鼠的脂肪组织SASP,并改善脂肪组织慢性炎症与功能紊乱。因此,本课题拟选用自然衰老的Wistar大鼠为研究对象,观察左卡尼汀对衰老大鼠脂肪组织功能的影响,进而探讨左卡尼汀是否能通过影响JNK/p53信号通路抑制大鼠脂肪组织SASP并改善衰老脂肪组织的慢性炎症状态和功能紊乱。研究目的1.明确左卡尼汀是否能抑制脂肪组织SASP,改善衰老脂肪组织的慢性炎症和功能紊乱。2.明确左卡尼汀是否能通过影响JNK/p53信号通路抑制脂肪组织SASP。研究方法1.实验动物分组选择3月龄的雄性Wistar大鼠及18月龄的雄性Wistar大鼠,随机分成4组:年轻组(3月龄,n=4),老年组(18月龄,n=4),年轻+左卡尼汀组(3月龄,n=4),老年+左卡尼汀组(18月龄,n=4)。所有大鼠用基础饲料分笼饲养,饮水和食物充足供应,维持大鼠正常的作息规律。年轻+左卡尼汀组大鼠和老年+左卡尼汀组大鼠给予300mg/kg/天左卡尼汀灌胃,时间为4周。实验结束后分离提取大鼠皮下白色脂肪组织及附睾白色脂肪组织。2.免疫组织化学染色通过免疫组织化学染色的方法测定脂肪组织CD3、CD4、Foxp3、CD68的表达,观察脂肪组织中T细胞、CD4+T细胞、Treg细胞及巨噬细胞的浸润情况。3.Western blot 检测提取大鼠脂肪组织蛋白质,通过Western blot检测p21、p16、IL-6、IL-1β、TGF-1β、TNF-α、p-Ser IRS1、IRS1、p-AKT、AKT、p-JNK、JNK、p53 和 p-actin的蛋白表达量。4.实时定量PCR检测通过Trizol法提取大鼠脂肪组织的总RNA,应用实时定量PCR技术检测Adiponectin、Leptin、p21、p16、IGF、MCP-1、MMP-3 的 mRNA 表达量。研究结果1.左卡尼汀改善脂肪组织衰老与年轻组大鼠相比,老年组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中衰老标志物p21、p16表达均增高,差异具有统计学意义(p0.05)。应用左卡尼汀干预后,与年轻组相比,年轻+左卡尼汀组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中p21、p16表达差异无统计学意义。与老年组相比,老年+左卡尼汀组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中p21、p16表达均下降,差异具有统计学意义(p0.05)。研究结果显示左卡尼汀可改善大鼠脂肪组织的衰老状态。2.左卡尼汀抑制衰老脂肪组织SASP因子分泌为了观察大鼠衰老脂肪组织SASP因子分泌情况,我们应用实时定量PCR技术检测了皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织相关细胞因子的mRNA表达水平。结果显示,与年轻组大鼠相比,老年组大鼠Adiponectin、Leptin、IGF、MCP-1、MMP-3表达均增高,差异具有统计学意义(p0.05)。应用左卡尼汀干预后,年轻组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中Adiponectin、Leptin、IGF、MCP-1、MMP-3表达在干预前后的差别无统计学意义;但与老年组相比,老年+左卡尼汀组大鼠Adiponectin、Leptin、IGF、MCP-1、MMP-3表达均下降,差异有统计学意义(p0.05)。上述结果表明,衰老脂肪组织分泌SASP因子的功能增强,左卡尼汀可抑制SASP因子的表达。3.左卡尼汀改善衰老脂肪组织慢性炎症状态为了观察左卡尼汀对衰老脂肪组织慢性炎症状态的改善作用,我们分别检测了大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织免疫细胞浸润情况及炎性因子表达水平变化。结果如下:3.1左卡尼汀改善衰老脂肪组织免疫细胞浸润与年轻组大鼠相比,老年组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中出现T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞以及巨噬细胞浸润。应用左卡尼汀干预后,与老年组大鼠相比,老年+左卡尼汀组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞以及巨噬细胞数量减少,干预前后的差异有统计学意义(p0.05)。上述结果说明左卡尼汀能减轻衰老脂肪组织中T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞以及巨噬细胞浸润。3.2左卡尼汀抑制衰老脂肪组织炎性因子表达与年轻组大鼠相比,老年组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中IL-6、IL-1β、TGF-1β、TNF-α表达量均增高,差异具有统计学意义(P0.05)。应用左卡尼汀干预后,与年轻组大鼠相比,年轻+左卡尼汀组大鼠上述炎性因子表达差异无统计学意义。与老年组大鼠相比,老年+左卡尼汀组大鼠IL-6、IL-1β、TGF-1β、TNF-α表达均下降,二者差异具有统计学意义(p0.05)。上述研究结果说明,衰老脂肪组织分泌炎性因子功能增强,而左卡尼汀可有效抑制衰老脂肪组织炎性因子释放,改善脂肪组织慢性炎症状态。4.左卡尼汀改善PI3K/AKT胰岛素信号通路功能与年轻组大鼠相比,老年组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中IRS1表达量下降,p-Ser IRS1/IRS1升高,p-AKT/AKT下降,二者差异均具有统计学意义(p0.05)。应用左卡尼汀干预后,与年轻组大鼠相比,年轻+左卡尼汀组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中IRS1及p-Ser IRS1/IRS1、p-AKT/AKT差异均无统计学意义。与老年组大鼠相比,老年+左卡尼汀组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中IRS1表达均上升,p-Ser IRS1/IRS1均下降,p-AKT/AKT升高,差异均具有统计学意义(p0.05)。上述结果说明,衰老脂肪组织P13K/AKT胰岛素信号通路功能出现异常。左卡尼汀能够提高PI3K/AKT胰岛素信号通路的活化,改善衰老脂肪组织PI3K/AKT胰岛素信号通路的功能。5.左卡尼汀抑制JNK/p53信号通路功能与年轻组大鼠相比,老年组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中p-JNK/JNK及p53表达均出现增加,二者差异具有统计学意义(p0.05)。应用左卡尼汀干预后,与年轻组大鼠相比,年轻+左卡尼汀组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中p-JNK/JNK、p53差异均无统计学意义。与老年组大鼠相比,老年+左卡尼汀组大鼠皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织中p-JNK/JNK、p53均下降,二者差异具有统计学意义(p0.05)。上述结果说明,脂肪组织衰老过程中伴随JNK、p53的高表达,JNK/p53信号通路可能参与了大鼠脂肪组织衰老过程,应用左卡尼汀可有效地抑制JNK/p53信号通路的活化。研究结论1.衰老脂肪组织炎性因子、脂肪因子与基质金属蛋白酶等SASP因子表达增加,同时伴有大量免疫细胞浸润,脂肪组织表现为慢性炎症状态。2.左卡尼汀可减轻衰老脂肪组织的免疫细胞浸润并抑制SASP因子的分泌,改善衰老脂肪组织的慢性炎症状态及功能紊乱。3.左卡尼汀对JNK/p53通路有抑制作用,可能是左卡尼汀抑制脂肪组织SASP,改善衰老脂肪组织慢性炎症及功能紊乱的关键机制。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：
图２左卡尼汀抑制衰老脂肪组织ＳＡＳＰ因子分泌??ａ：实时定量?ＰＣＲ?检测?ＳＷＡＴ?中?Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｌｅｐｔｉｎ、ＩＧＦ、ＭＣＰ－１、ＭＭＰ－３?ｍＲＮＡ??的表达；ｂ：实时定量?ＰＣＲ?检测?ＶＷＡＴ?中?Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、Ｌｅｐｔｉｎ、ＩＧＦ、ＭＣＰ－１、??ＭＭＰ－３?ｍＲＮＡ?的表达；ｎ＝４；?Ｖ＜０．０５，?＊＊?ｐ＜０．０１，＊＊＊尸＜０．００１?ｖｓ＿?Ｙ；?＃尸＜０．０５，滞??／＾Ｏ．Ｏｌ＾／ＫＯ．ＯＯｌ?ｖｓ．?Ａ。ＳＷＡＴ：皮下白色脂肪组织；ＶＷＡＴ：内脏（附睾）白??色脂肪组织；Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ：脂联素；Ｌｅｐｔｉｎ：瘦素。Ｙ：年轻组；Ａ：老年组；??Ｙ＋Ｌ：年轻＋左卡尼汀组；Ａ＋Ｌ：老年＋左卡尼汀组。??
图３左卡尼汀改菩衰老脂肪组织免疫细胞浸润??ａ：免疫组织化学染色技术观察ＳＷＡＴ中ＣＤ３、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３和ＣＤ６８表达；ｂ：??免疫组织化学染色技术观察ＶＷＡＴ中ＣＤ３、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３和ＣＤ６８表达。ｎ＝４；??＊ｐ＜０．０５，?＊＝＾＜０．０１?ｖｓ．?Ｙ；?＃／？＜０．０５，?＾ｐＯ．Ｏｌ?ｖｓ．?Ａ。ＳＷＡＴ：皮下白色脂肪组织；??ＶＷＡＴ：内脏（附睾）白色脂肪组织。Ｙ：年轻组；Ａ：老年组；Ｙ＋Ｌ：年轻＋左??卡尼汀组；Ａ＋Ｌ：老年＋左卡尼汀组。??
图４左卡尼汀抑制衰老脂肪组织炎性因子表达??ａ：?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?检测?ＳＷＡＴ?中丨Ｌ－６、丨Ｌ－ｉｐ、ＴＧＦ－ｐｌ、ＴＮＦ－ｃｔ表达；ｂ：?Ｗｅｓｔｅｒｎ??ｂｌｏｔ?检测?ＶＷＡＴ?中?ｌＬ－６、ＩＬ－ｌｐ、ＴＧＦ－ｐｌ、ＴＮＦ－ａ表达。ｎ＝４；?＊尸＜０．０５，?＊＊／？＜０．０ｌ??ｖｓ．Ｙ；Ｖ：０．０５，＃＃ｐ＜０．０Ｉ?ｖｓ．Ａ。ＳＷＡＴ：皮下白色脂肪组织；ＶＷＡＴ：内脏（附睾）??白色脂肪组织。Ｙ：年轻组；Ａ：老年组；Ｙ＋Ｌ：年轻＋左卡尼汀组；Ａ＋Ｌ：老??年＋左卡尼汀组。??
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本文编号：
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