人诱导多能干细胞源性心肌细胞实时细胞评价系统评价药物心脏毒性方法的建立

发布时间：2020-10-29 16:55

　　 背景:生物工程和体外培养技术的进步导致了用于药物疗效/毒性测试[1]、疾病建模[2],以及心脏发育的力学研究[3-5]的心肌模型开发的迅速扩大。然而,这类技术的广泛应用是建立可靠的人类心肌细胞来源的基础上,这一技术被广泛应用于构建能够准确模拟活体组织的工程化的人类心脏结构。为此,科学家近年来致力于开发新型工程仿生心脏组织平台,以准确地再现人类心肌的结构和功能。在心脏工程领域,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)因为其来自于自身体细胞,故能够开发基于个体的医疗策略和特定患者的疾病模型,具备广阔的应用前景。迄今为止用于心脏建模的其他方法包括使用仙台病毒载体[6-8],该方法消除了与将转基因整合到宿主细胞基因组有关的翻译问题。此外,利用等体质粒[9-12]、microRNAs[13]和直接蛋白质传递[14-18]都被证明能够产生可分化为跳动的心肌细胞的ipSCs。对于在推进临床和基础科学研究中使用iPSC线的热情,人们对这些细胞是否与ESCs相同表示了关注。一方面,有人认为iPSCs和ESCs几乎相同,因为这两种细胞在体外表现出相似的表型、依赖性和行为[19-23]。此外,对大量克隆进行的分析表明,iPSC和ESC源在细胞特性方面存在相当大的重叠,因此,如果不进行深入测试,很难区分它们[24-28]。另一方面,微阵列研究表明,数百个基因以及DNA甲基化模式在iPSCs和ESCs之间存在差异表达[28-32]。总体而言,对iPSC和ESC系一系列特性的测量,包括基因表达、DNA甲基化、微RNA表达、分化倾向和胚胎中的互补活性,表明它们的特性确实不同[32-38]。虽然iPSC和ESC细胞之间存在着特定的差异,但是很少有确凿的证据表明,从这些细胞来源产生的心肌细胞一旦分化就会有任何有意义的区别。因此,尽管未分化干细胞来源有明显不同,iPSCs和ESC衍生心肌细胞之间具有高度的可比性,而且通常采用的心脏分化方法的重复性,再加上iPSCs在疾病建模和个性化医学应用方面的优势,使得iPSCs在临床和基础心脏研究应用中都具有广阔的应用前景。目的:建立适合于药物心脏毒性评价的人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CM)模型,并采用此模型评价化合物潜在的心脏毒性。方法:研究选用不同种类的心脏毒性药物:蒽环类抗癌药阿霉素(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10 μ mol·L-1)、Ⅲ类抗心律失常药物胺碘酮(10 nmol·L-1、100nmol.L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1)、钙离子通道阻滞剂维拉帕米(10nmol·L-1、100nmol·L-1、1μmol·L-1 和 10μmol·L-1),分别与hiPSC-CM孵育,采用实时细胞分析法实时监测心肌细胞搏动的频率、振幅、细胞指数、场电位时程等指标在给药前后的变化,建立人诱导多能干细胞分化的心肌细胞体外心脏毒性评价模型。结果:1.心肌细胞的纯度鉴定为了验证诱导多能干细胞源性心肌细胞实时细胞评价系统的精确性,采用流式细胞术的方法进行检测心肌细胞特征性蛋白肌钙蛋白(cardiac troponin T,cTnT)从而证明心肌细胞纯度达99%。形态学纯度鉴定指出分化的心肌细胞中肌钙蛋白含量较高。2.胺碘酮对hiPSC-CM相关指标的影响为了验证胺碘酮对hiPSC-CM相关指标的影响,我们检测了 hiPSC-CM的收缩力、收缩频率、增殖曲线和场电位时程(FPDc)。结果显示:hiPSC-CM搏动稳定后,给予不动浓度的胺碘酮(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、300 nmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1)后,结果显示,10nmol·L-1、100nmol·L-1、30 nmol·L-1三个浓度对心肌收缩力、收缩频率、增殖曲线、场电位时程均不产生统计学意义的影响;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮给药后,显示出对hiPSC-CM收缩力、收缩频率的完全抑制;1μmol·L-1、10μmol·L-1的胺碘酮给药后48h开始显示出统计学差异的细胞数量减低作用,显示出细胞脱落增多,且10 μmol·L-1组细胞减少数量比1μmol·L-1组稍多,但并无统计学差异;10μmol·L-1的胺碘酮给药后12h,显示出对hiPSC-CM自主则的完全抑制;而1μmol·L-1浓度处理组大部分自主完全抑制,尚有少数仍有搏动。3.维拉帕米对hiPSC-CM相关指标的影响为了验证维拉帕米对hiPSC-CM相关指标的影响,我们检测了 hiPSC-CM的搏动状态、收缩力、收缩频率、增殖曲线和场电位时程(FPDc)。结果显示:hiPSC-CM搏动稳定后,给予不动浓度的维拉帕米(10nmol·L-1、100nmol·L-1、1μmol·L-1、10 μmol·L-1)后,结果显示,10nmol·L-1、100nmol·L-1两个浓度对心肌收缩力、收缩频率、增殖曲线、场电位时程均不产生统计学意义的影响;随着浓度的升高表现出对hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。4.阿霉素对hiPSC-CM相关指标的影响为了验证阿霉素对hiPSC-CM相关指标的影响,我们检测了 hiPSC-CM的搏动状态、收缩力、收缩频率、增殖曲线和场电位时程(FPDc)。结果显示:hiPSC-CM搏动稳定后,给予不动浓度的阿霉素(10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1)后,结果显示,10nmol·L-1、100nmol·L-1两个浓度对心肌收缩力、收缩频率、增殖曲线、场电位时程均不产生统计学意义的影响;随着浓度的升高表现出对hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。5.PM2.5对hiPSC-CM相关指标的影响为了验证PM2.5对hiPSC-CM相关指标的影响,我们检测了 hiPSC-CM的收缩力、收缩频率和增殖曲线。结果显示:hiPSC-CM搏动稳定后,给予不动浓度的PM2.5(10μg/ml、100μg/ml、100Oμg/ml)后,结果显示,10μg/ml、100μg/ml两个浓度对心肌收缩力、收缩频率、增殖曲线均不产生统计学意义的影响;随着浓度的升高为1000 μg/ml时表现出对hiPSC-CM的抑制作用(P0.05)。结论:利用人诱导多能干细胞分化的心肌细胞可以建立一种可行的体外心脏毒性评价模型,结合实时细胞分析法可快速、灵敏、准确的评价药物的心脏毒性
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

图１．胺碘酮对ｈｉＰＳＣ－ＣＭ收缩力（幅度）的影响??表１．胺碘酮对ｈｉＰＳＣ－ＣＭ收缩力（幅度）的影响＊Ｐ＜０．０５??￣￣?给药前￣给药后￣给药后?给药后￣给药后￣给药后￣给药后￣给药后￣给药后￣给药后￣给药后?给药后??７７?ｚＨ??１２ｈ?２４ｈ?３６ｈ?４８ｈ?６０ｈ?７２ｈ?７６ｈ?８０ｈ?８４?ｈ?９０ｈ?９６ｈ??０?ｌ°．ＤＭＳＯ?１００１０００?１０５±?００８?１．０４土０?０４?１０５土００６?１０５±００４?１．０７±０?０４?１．１１±０?０６?１．０６ｉ０?０６?１．１３±０１０?１０５±０．０８?１．１６±００８?１〇７±〇１〇??１０?ｎｍｏｌ?Ｌ－１?１．００＊０?００?０．９９±００５?０．９９±０１４?］?０６±０?０６?１０９±０１４?１．０５±０．１３?０．９２±０１０?０．８９＊０?０８?１．００±００６?１０１?±０．０８?０．９８±００８?０．８８±０．０７??ｌＯＯｉｉｍｏｌＬ－１?１００?士０．００?０．９９±?０?０５?１．２１±０１２?１２４＊０１４?１０９±０１３?ｌ．］７±〇１５?１．１０±０１１?１．１０＊０．０９?１．０２＊０．０７?０．９４?±０．０７?１．００±００５?０９８±００５??３００?ｎｍｏｌ?Ｌ－１?ｌ．ＯＯｉＯ?ＯＯ?１．０５±０１２?１．２５±０１７?１１３±０１８?１０２±０１３?０．９４±０?０９?０．９８＊０．１３?１．００±０１２?１．１１±０１１?１０７±０．２０?１．０９±０?０６?１．０３±０．〇７??１?晴ｊＬ．ｌ?１．００１０．００?０．１６±０．１６?０，４４?±０．２８?０．０７±０

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予不同浓度的胺碘酮（１０?ｎｍｏｌ．Ｌ－１、１００?ｎｍｏｌ．Ｉ／１、３００?ｎｍｏｌ．Ｌ＇?ｌ｜ｉｍｏｌ．Ｌ＿１、１０??ｐｍｏｌ．Ｌ－１）后，增殖曲线随时间变化的曲线图见图３和表３，?ｌｐｍｏｌ．Ｌ＇ｌＯ＾ｍｏｌ．Ｉ；１??的胺碘酮给药后４８ｈ开始显示出统计学差异的细胞数量减低作用，显示出细胞??脱落增多，且ｌＯｐｍｏｌ?Ｌ／１组细胞减少数量比ｌｐｍｏｌ?Ｌ／１组稍多，但并无统计学差??异。１０?ｎｍｏｌ?Ｌ—１、１００?ｎｍｏｌ?Ｌ＇１、３００?ｎｍｏｌ?Ｕ１组别对增殖曲线不产生统计学意义??的影响。??２．０?ｎ??０．１％ＤＭＳＯ??１０?ｎｍｏｌ－?Ｌ－１??１?５－?ｌＯＯｎｍｏｌ－?Ｌ－１??３００ｎｍｏｌ－?Ｌ－１??ｃＳ?１｜ｊｍｏｌ－?Ｌ－１??Ｊ?１。＿?Ｍ??０．５－??０?１２?２４?３６?４８?６０?７２?８４?９６??ｔｉｍｅ（ｈ）??图３．胺碘酮对ｈｉＰＳＣ－ＣＭ增殖曲线的影响??表３胺碘酮对ｈｉＰＳＣ－ＣＭ增殖曲线的影响＊Ｐ＜０．〇５??２１??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 王广鹤;甄玲燕;吕鹏;蒋蓉芳;宋伟民;;臭氧和细颗粒物暴露对大鼠心脏自主神经系统和系统炎症的影响[J];卫生研究;2013年04期

相关博士学位论文 前1条

1 段军;可吸入颗粒物对大鼠心脏交感神经分布和神经生长因子表达的影响及β受体阻滞剂的干预作用[D];北京协和医学院;2012年

本文编号：2861189