胰高血糖素样肽-1类似物的合成及活性研究

发布时间：2020-11-03 15:25

　　 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)具有降低血糖、减轻体重、心血管受益,改善β细胞等多种生理功能,在治疗2型糖尿病和肥胖症方面是最具潜力的一类药物。然而,天然的GLP-1易被DPP-IV降解、肾脏滤除、血液中酶降解,在体内半衰期不足2 min。因此,为了给患者提供更多的选择,开发长效或口服的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物已经成为热门的研究方向。本研究设计合成了胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。其结构是把天然GLP-1的第八位丙氨酸突变成甘氨酸或氨基异丁酸,并在C端或第26位赖氨酸侧链增加Cys作为偶联人血清白蛋白的中介。采用Fmoc固相合成制备化合物,DTNP修饰多肽链形成新的二硫键,经HPLC纯化,质谱鉴定与理论值一致。与白蛋白定向偶联后,SDS-PAGE分析表明偶联率较高。动物实验结果表明,化合物2-HSA(GLP-1(7-37)(Ala8Gly)-Ala-Ala-Cys-HSA)降糖效果达到72 h,化合物5-HSA(GLP-1(7-37)(Ala8Aib)-Cys-HSA)降糖疗效长达1周,在正常小鼠和2型糖尿病模型大鼠中均具有良好的降糖活性,同时胰岛素分泌显著提高,有望一周注射一次应用于治疗2型糖尿病。为了提高患者依从性,本文对口服GLP-1类似物进行了初步研究。本研究通过生物信息学分析,将利拉鲁肽第8位和第30、33、34、35位氨基酸进行突变,设计了3个GLP-1类似物。采用Fmoc固相合成制备类似物,HPLC分析纯化,质谱鉴定结果均与理论值一致。随后,分别加入10 mM化合物XLCA、100 mM的SNAC作为辅助渗透剂,分别在胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中进行水解实验。质谱鉴定结果表明,加100 mM的SNAC在30 min内能抵抗胰蛋白酶水解类似物1,而加10 mM化合物XLCA抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶水解作用在大多数情况下是明显优于SNAC的。类似物1(GLP-1(7-37)(8Aib:26Kε:γGlu-C16))在加4 mM化合物XLCA的情况下在糜蛋白酶、胰蛋白酶中37℃水解24 h仍有大部分存在,有望制成肠溶制剂用于口服给药。
【学位单位】：湖南理工学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96;TQ460.6
【部分图文】：

南理工学院硕士学位论文 第1章 绪交酯-co-乙交酯，这种材料不仅有着很好的生物相容性，还能在注射部位大大的延缓释放，半衰期达到 4 d，在 2012 年被 FDA 批准上市。艾塞那肽-QW 以 2 mg/周剂量注射一次治疗，可以使糖化血红蛋白 HbA1c 减少 1.3～1.9%，体重超过 30 周减少 2.7 kg，血糖调节相比普通的艾塞那肽更加有效，相比艾塞那肽明显减少消化道症状[65-67

Efpeglenatide Sanofi PhsaeⅢSubcutaneousinjectionWeeklyITCA 650 Intarcia PhsaeⅢSubcutaneouspumpOnce a yearCJC-1131-PC Conjuchem PhsaeⅡSubcutaneousinjectionWeeklyGlymera PHSAeBio PhsaeⅡSubcutaneousinjectionWeeklyTTP273/ TTP054 TransTech PhsaeⅡ Oral Daily（1）Semaglutide(索马鲁肽口服)：为了提高患者顺应性，诺和诺德运用了 Eligen系统开发了口服制剂，其中最重要的成分是辅助促渗剂 N-[8-(2-hydroxybenzoyl) amprylate (SNAC)，通过与多肽类药物之间通过非共价结合，增加脂溶性和通透性从多肽类药物的被动吸收，同时可以减少多肽类药物吸收转运过程的酶水解失活[86]数据表明，索马鲁肽每日口服 40 mg 的疗效和每周 1 mg 的注射给药疗效一致，目实验接近完成[87]。

用 1 M 盐酸调 pH 至 6.8，加水定容至 100 mL，用棕色瓶 4 ℃保存。（12）1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）浓缩胶缓冲液：称取 18.15 g Tris-HCl，加 80 mL 溶解，用 1 M 盐酸调 pH 至 8.8，加水定容至 100 mL，用棕色瓶 4 ℃保存。（13）染色液：称取 1 g 考马斯亮蓝 R-250 至 1 L 烧杯中，加 250 mL 的异丙醇搅溶解，再加入 100 mL 冰醋酸、650 mL 水搅拌均匀，过滤，室温保存。（14）脱色液：分别量取 100 mL 醋酸、50 mL 乙醇、850 mL 水至 1 L 烧杯混匀。2.2 实验方法2.2.1 目的多肽设计由于天然 GLP-1 容易被 DPP-IV 酶水解、肾脏滤除，半衰期不足 2 min。因此，为抵抗 DPP-IV 酶水解，把天然 GLP-1 的第八位丙氨酸突变成甘氨酸或氨基异丁酸，同时了减少肾脏滤除，增大分子量，就在 C 端或第 26 位赖氨酸侧链增加 Cys 作为偶联人血白蛋白的中介（如图 2-1 所示）。本文采用化学合成法制备胰高血糖素样肽-1 与人血清蛋白（HSA）的融合蛋白。
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本文编号：2868756