载核酸药物纳米复合物的构建与评价

发布时间：2020-11-10 00:53

　　 目的:近年来,基因治疗的发展非常迅速。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是基因治疗中最重要的发现之一,在治疗肿瘤和病毒感染方面具有很大的使用潜力,得到了人们的广泛关注。但是RNAi本身的一些理化性质限制了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的应用,稳定性较差,易被生物体内的核酸酶降解,降低了siRNA的应用效率;并且siRNA分子量较大,具有亲水性和负电性,这些都影响了siRNA的跨膜转运效果。因此,如何能够将siRNA成功地转运至细胞质中并发挥治疗效果成为人们研究的热点。在siRNA的应用研究中,一个重要的目的就是能够使siRNA成功穿透细胞膜,进入到细胞质中发挥疗效。因此,细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)引起了人们的关注。细胞穿膜肽是由5-30个氨基酸按照一定的顺序组成的两性或阳性的短肽链。它能够高效地穿过细胞膜,且能够介导其它生物大分子(比如siRNA)进入细胞质中,是目前研究较热的药物载体。本研究选用了具有类似穿膜肽性质的八聚组氨酸(H8),它是由8个组氨酸分子反应生成的一种阳性短肽,为了提高H8的穿膜效率,将H8与疏水基团(硬脂酸,SA)反应,合成SA-H8和SA-H8-PEG2000两种阳性载体,将合成的载体通过静电作用与siRNA结合,组成SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA纳米复合物。通过测定纳米复合物的电位、粒径、凝胶阻滞能力考察SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA的理化性质,筛选出了SA-H8-PEG2000/siRNA和SA-H8-PEG2000n/siRNA的最佳处方配比。以MCF-7细胞和A549细胞为模型,考察载体与细胞之间的相互作用,评价细胞对载体药物的摄取效率。方法:通过查阅文献和试验探索,确定了SA-H8和SA-H8-PEG2000两种阳性载体材料的合成和纯化方法。将sa和h8在室温条件下搅拌反应1h,用纯净水进行透析纯化,直接冻干备用,即得目的产物sa-h8。将sa-h8与mpeg2000-mal溶液混合,避光反应48h,用纯净水透析纯化,即得产物sa-h8-peg2000。以制剂的粒径、电位和琼脂糖凝胶电泳行为为指标,考察制剂的理化性质,筛选出最佳处方配比。选择mcf-7细胞和a549细胞为细胞模型,以流式细胞分析的方法测定细胞的荧光强度,通过荧光强度的强弱来判定细胞的摄取效率,以评价载体对sirna的转染效率的贡献。结果:将合成的产物进行质谱分析,结果显示合成得到sa-h8和sa-h8-peg2000两种共轭物。以sirna作为模型效应分子,通过室温涡旋孵育的方法得到sa-h8-peg200020%/sirna、sa-h8-peg200050%/sirna和sa-h8-peg2000/sirna纳米复合物。通过测定电位、粒径以及凝胶阻滞试验得到了纳米复合物的理化性质。sa-h8-peg200020%/sirna处方粒径在200nm-700nm之间,且随着n/p比的增加而变大。从琼脂糖凝胶电泳的结果可以分析得到,当n/p比为80时,仍然能够看到清晰的条带,说明sirna未被完全包载,sa-h8-peg200020%对sirna的包载能力较差。sa-h8-peg2000的比例提高至50%之后,sa-h8-peg200050%/sirna处方粒径在350nm-450nm之间。n/p比为80时,sirna被完全包载。sa-h8-peg2000/sirna处方粒径在300nm-400nm之间,且粒度分布相对均匀,当n/p比大于或等于40时,实现sirna的完全包载。综上所述,选择sa-h8-peg200050%/sirna80:1和sa-h8-peg2000/sirna80:1作为最终处方。由流式细胞分析的结果可知:在a549与mcf-7细胞中,sa-h8-peg200050%/sirna和sa-h8-peg2000/sirna的细胞摄取率都随着时间的推移而增大,呈现明显的时间依赖性。sa-h8-peg200050%/sirna和sa-h8-peg2000/sirna两种载体形式的细胞摄取率明显高于游离sirna,但与市售制剂仍存在一定差距。结论:本研究所构建的载体可以有效包载siRNA并显著提高其细胞摄取水平。然而,为达到市售制剂的转染能力,仍有必要对载体的处方、制备工艺进一步优化和筛选。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R943
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩写
引言
第一部分 八聚组氨酸载体材料的合成
    前言
    材料与方法
    结果
    附图
    讨论
    小结
    参考文献
第二部分 载核酸药物纳米复合物的制备以及表征
    前言
    材料与方法
    结果
    附图
    附表
    讨论
    小结
    参考文献
第三部分 纳米复合物与细胞间的相互作用
    前言
    材料与方法
    结果
    附图
    附表
    讨论
    小结
    参考文献
结论
综述 脂质多聚复合物作为非病毒性基因载体的研究进展
    参考文献
致谢
个人简历

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本文编号：2877213