含色氨酸系列抗菌肽对多药耐药肺炎克雷伯菌MRKP1203抗菌活性的研究

发布时间：2020-11-10 07:56

　　 目前肺炎克雷伯菌对多种抗生素产生耐药性,治疗其引起的相关疾病成为临床上急待解决的难题。它与鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌被称为21世纪重症病房三大难以治疗的病原菌。因此,我们急需寻找新型药物来治疗多药耐药肺炎克雷伯菌引起的感染。抗菌肽的分子量小,热稳定性强,免疫原性低,具有很好的杀菌活性,而且不易产生耐药性。抗菌肽因其独特的杀菌机理而成为近年来的研究热点。Temporin-1CEb是本实验室从林蛙皮肤分泌物中分离纯化的天然抗菌肽,具有一定的抗菌活性。实验室前期以Temporin-1CEb为模板,通过赖氨酸、亮氨酸和色氨酸残基的替代,得到一系列含色氨酸的抗菌肽。这些含色氨酸系列抗菌肽对耐药铜绿假单胞菌和耐药表皮葡萄球菌等革兰氏阴性和阳性细菌均具有高的杀菌活性,而且对细菌的细胞膜具有一定的破坏作用。本文研究了含色氨酸系列抗菌肽对临床分离的多药耐药肺炎克雷伯菌(MRKP1203)的杀菌活性、作用机制以及对小鼠肺部感染MRKP1203的治疗作用。含色氨酸系列抗菌肽对MRKP1203菌株显示了良好的抗菌活性,MIC值为12.5-50μM,其中I4W与I1WL5W有较强的抗菌活性,其MIC值均为12.5μM。杀菌动力学实验结果表明含色氨酸系列抗菌肽对MRKP1203的杀菌活性与其浓度及作用时间呈正比,I4W、L12W和I1WL5W处理的细菌分别在16×MIC、120 min,16×MIC、180 min和8×MIC、180 min时全部死亡。抗生素后效应实验(PAE)研究了经抗菌肽处理后的细菌恢复对数生长期所需的时间。结果表明,经含色氨酸系列抗菌肽处理后的MRKP1203的抗生素后效应时间为2-5 h。扫描电镜观察不同浓度抗菌肽对MRKP1203形态的影响,结果发现与对照组相比,经2×MIC的I4W、L12W和I1WL5W处理后,MRKP1203菌株的表面粗糙,细胞膜内陷,细菌细胞中的物质外泄,致使细菌死亡。随后研究了含色氨酸系列抗菌肽对MRKP1203菌株细胞外膜和内膜通透性的影响。细胞膜去极化实验结果显示,加入I4W、L12W和I1WL5W仅1 min,DiSC3-5荧光值显著增加,当肽浓度增加到4×MIC时,三种抗菌肽中DiSC3-5荧光值分别增加了68%、59.5%和72.4%;阳性对照TritonX-100增加了90%,而阴性对照万古霉素仅增加了27%。这一结果提示含色氨酸系列抗菌肽可以诱导MRKP1203菌株细胞膜发生去极化,增加细胞膜的通透性。含色氨酸系列抗菌肽中的色氨酸残基在波长340 nm处有特异的荧光吸收,当色氨酸的侧链插入细胞膜中,其荧光光谱会发生改变。我们选择含色氨酸系列抗菌肽与MRKP1203菌悬液相互作用,测定色氨酸残基荧光光谱的变化。实验结果显示3个含色氨酸系列抗菌肽在MRKP1203细菌溶液中,色氨酸残基在340 nm的吸收峰发生了不同程度的蓝移,其中I1WL5W蓝移效果最明显,为32 nm;I4W和L12W蓝移30 nm和26 nm。该结果提示含色氨酸系列抗菌肽中的色氨酸残基能够插入到MRKP1203菌的膜磷脂双分子层中,破坏细胞膜的稳定性,从而杀死细菌。人工模拟肺炎克雷伯菌细胞膜通透性的影响实验结果也同样显示含色氨酸系列抗菌肽增加了细菌细胞膜的通透性。I4W、L12W和I1WL5W分别在浓度为6.25μM、12.5μM和6.25μM时使钙黄绿素的释放达到100%。以上实验证明了含色氨酸系列抗菌肽能够使MRKP1203菌株细胞膜的通透性发生改变,膜的完整性受到破坏。进一步地,我们利用疏水性的荧光探针NPN检测了含色氨酸系列抗菌肽对MRKP1203菌外膜通透性的影响。结果显示3个含色氨酸系列抗菌肽可以不同程度的增加MRKP1203外膜的通透性,且呈浓度依赖性。接下来我们进行了激光共聚焦实验,实验结果显示,加入抗菌肽后,绿色的活细菌数量与对照组相比明显减少,而红色的死细菌数量增加,且随着抗菌肽浓度的增加,细菌死亡数量也随之增长;当I4W和I1WL5W浓度增加到25μM时,视野内90%以上都是呈红色荧光的死细菌。这一结果提示含色氨酸系列抗菌肽能够破坏MRKP1203细胞膜的完整性。在含色氨酸系列抗菌肽I1WL5W治疗小鼠肺部感染MRKP1203菌株的实验中,通过对小鼠肺组织和血液中的菌落数、炎症因子TNF-α和IL-6含量的检测,以及肺组织的组织化学染色,分析I1WL5W对肺部感染小鼠的治疗作用。实验结果显示不同剂量(2、4和8 mg/kg)的I1WL5W作用肺部感染小鼠3天后,血液中细菌数量与模型组相比,下降了10-25.39%;TNF-α和IL-6分别降低了17.09-23.27%和7.42-10.35%;治疗6天后,血液中细菌数量与模型组相比,减少了42.72-84.98%;TNF-α和IL-6分别降低了31.42-48.94%和19.71-41.17%;治疗9天后,血液中细菌数量与模型组相比,减少了54.58-92.24%;TNF-α和IL-6分别降低了33.52-89.71%和51.58-87.45%。小鼠肺部组织化学(HE染色)结果显示,与对照组相比,I1WL5W能使MRKP1203感染的小鼠肺组织重新恢复网状的疏松结构,肺泡腔内也变得干净、无渗出物,细胞壁也比较完整,提示含色氨酸抗菌肽I1WL5W可以抑制炎症因子的表达,有效治疗小鼠肺部感染。
【学位单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96
【部分图文】：

图 1.1 抗菌肽对细菌膜作用的模型 （此图引自 Copyright 2005 American Chemical Society）Fig. 1.1 Various models of antimicrobial peptide activity

含色氨酸抗菌肽对多药耐药肺炎克雷伯菌抗菌活性的研究和时间依赖的。 I4W、L12W 和 I1WL5W 在浓度为 16×MIC 时将细菌全部杀死分别需要 120 min、180 min 和 120 min。阳性对照庆大霉素在 1×MIC 的浓度时，对 MRKP120菌株的作用效果与 1×MIC 的抗菌肽的抗菌活性相似。

图 2.2 含色氨酸系列抗菌肽对 MRKP1203 的 PAE 实验A：I4W；B：L12W；C：I1WL5WFig.2.2 PAE of MRKP1203 treated with the Trp-containing antimicrobial peptidesA: I4W; B: L12W; C: I1WL5W2.3.4 含色氨酸系列抗菌肽对 MRKP1203 细菌形态的影响通过扫描电镜观察 MRKP1203 菌株在含色氨酸系列抗菌肽作用下的形态变化，实验结果见图 2.3。观察实验结果，我们发现未经抗菌肽作用的对照组细菌细胞膜完好无缺，菌体光滑饱满，边缘清晰。经不同浓度抗菌肽作用后，细菌菌体形态发生不同程度的变化，1×MIC 时细菌表面粗糙并凹陷，2×MIC 作用时，菌体表面破裂，有大量的内容物泄露出来；并且相同浓度下，不同抗菌肽对 MRKP1203 菌株的作用效果也不完全相同，抗菌肽 I1WL5W 比 I4W 和 L12W 对 MRKP1203 菌株的作用效果更强。本实验中，经三种含色氨酸抗菌肽作用后，细菌表面形态发生不同程度的变化，说明抗菌肽破坏细菌细胞膜，使细菌内部的物质向外泄漏，从而导致细菌死亡。
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1 马艳军;含色氨酸系列抗菌肽对多药耐药肺炎克雷伯菌MRKP1203抗菌活性的研究[D];辽宁师范大学;2019年

本文编号：2877687