MEHP荧光探针的合成及其在毒靶细胞的原位检测

发布时间：2020-11-10 09:05

　　 背景邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di(2-ethylhexy1)phthalate,DEHP]为代表的邻苯二甲酸酯类塑化剂是公认的环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupting chemicals,EEDs)。可透过人体血-睾屏障、血-脑屏障,破坏人体的生殖系统及神经系统。DEHP经人体吸收,可快速水解为邻苯二甲酸单乙基乙酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP],在人体长期蓄积,产生生殖毒性和雌激素效应。5-氨基荧光素(5-Aminofluorescein,5-AF)是一小分子化学物质,是氨基类荧光素。其活性氨基基团能与生物分子中的羧基结合,结合后荧光强度大大增强,因而广泛应用于蛋白质分析和免疫学研究。目的合成具有荧光示踪的MEHP,旨在用于细胞及分子水平的毒性机理研究。方法1.MEHP与5-氨基荧光素(5-AF)经酰胺脱水缩合反应制备MEHP衍生物荧光探针(MEHP-AF)。2.MEHP-AF纯化后经液相色谱-质谱(HPLC-MS)、傅里叶变换红外光谱等进行纯度、结构鉴定,以荧光稳态和荧光瞬态进行探针的荧光特性分析。3.实验以Hela细胞为对象,比较5-AF与MEHP-AF的性能差异;以时间为变量研究MEHP-AF的入胞特征;以藻红蛋白标记的雌激素受体(estrogen receptor,ER)抗体定位Hela细胞探讨MEHP-AF与ER的相互作用。结果1.MEHP-AF为结构全新的化合物。分子式为C36H33N08,分子量为607.65。2.理化特征表明,MEHP-AF为红褐色油状物。与MEHP化学性质相似,不溶于水,而溶解氯仿、乙醇等有机溶剂。经纯化后的MEHP-AF的纯度含量达92.4%。3.5-AF与MEHP-AF的性能差异结果表明,水溶性的5-AF在浓度高达100 μM难以进入细胞内,而MEHP-AF在浓度低至1 μM即可分布至细胞质与细胞核。在15 min可见MEHP--AF透过细胞膜进入胞质,少量达到细胞核;随着作用时间增加进入到细胞核的量也明显增加。ER为核受体,也可分布在细胞膜与细胞质。MEHP-AF能与ER结合呈现出黄色荧光,荧光密度随作用时间延长而更强。结论MEHP-AF作为一种新颖的荧光探针,它具有MEHP的脂溶性和5-AF的荧光特性。能在靶细胞原位、实时及可视化进行MEHP的亚细胞及分子水平的毒性机制研究。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R99;O657.3
【部分图文】：

DEHP的代谢[来自KochFIM等.200习Fig2.MetabolismofDEHP(accordingKochetx1.2005)

５．４实验结果??５．４．１傅里叶变换红外光谱检测??如图５所示，对ＭＥＨＰ－ＡＦ、ＭＥＨＰ、５－ＡＦ进行了傅里叶变换红外光谱检测。??在５－ＡＦ的光谱中，在－ＮＨ２－的伸缩振动区间３５００?ｃｎｒＭｌＯＯｃｎｒ１内，蓝箭头所指??区域出现了相应的伸缩振动。在ＭＥＨＰ的光谱图中，在饱和链烃－ＣＨ２－的伸缩振??动区间３０００?ｃｍ－ＷｅＯＯ?ｃｎｒ１和－Ｃ＝０的伸缩振动区间１８２０?ｃｎ＾－ｉｅＳＯ?ｃｍ－１内，红??箭头所指的相应位置出现了伸缩振动，并且出现了羧基羰基和酯基羰基对称双羰??基伸缩振动。产物ＭＥＨＰ－ＡＦ的红外光谱中，在－ＮＨ２－的伸缩振动区间３５００??内，出现了相应的伸缩振动，但是，振动巾ｇ度明显降低，表明氨基??链接基团改变。在－ＣＨ２－的伸缩振动区间３０００?ｃｎ＾ＪＳＯＯ?ｃｍ－１和－Ｃ＝０的伸缩振??动区间１８２０?ｃｎｒＭＳａＯ?ｃｒｒｒ１内，黑色箭头所指部位均出现了相应的伸缩振动，在??－Ｃ＝０的伸缩振动区域

?５．４．２液相色谱－质谱（ＨＰＬＣ－ＭＳ）检测??如图６?（Ａ）所示，该流动相条件下，ＭＥＨＰ－ＡＦ，?ＭＥＨＰ，５－ＡＦ，可以完全??分离。５－ＡＦ保留时间２．１６ｍｉｎ，?ＭＥＨＰ的保留时间为２７．４２ｍｉｎ。ＭＥＨＰ－ＡＦ及少??量杂质的保留时间分别为４．９７ｍｉｎ、３．４０ｍｉｎ，峰面积之比为０．９２４。ＨＰＬＣ说明??了?ＭＥＨＰ－ＡＦ的产物中没有５－ＡＦ的残留，且纯度为９２．４％。６（Ｂ）图是ＭＥＨＰ－ＡＦ??的负相质谱图，６０６．１０与理论计算ＭＥＨＰ－ＡＦ的相对分子质量６０７去掉一个氢原??子一致。液相色谱－质谱的结果说明，ＭＥＨＰ－ＡＦ成功合成。??Ａ??ＭＥＨＰ－ＡＦ?Ｂ????．ｉｒｔ９?１?－Ｅ５ｉ?Ｓｃａｎ?１－３．ｉ??Ｖ??Ｗｃｎｒ＊?．??■?｜?——５－ＡＦ?Ｔ??？?ｒ４?６５??Ｓ－??ｆ：?．?Ｉ?：：??－?￣￣?????????３Ｓ－??＾?Ｉ??－?Ｉ?７？＊?１３??．？５．３Ｃ??．Ｉ?１?？．…?—??〇?５?１Ｑ?１５?２０?２５?３０?？：ｓ?ｆｋ?ｍ?＊ａ?ｓｏ：?ｅｓａ?７３ｃ?ｓｃｓ?９５Ｃ?ｉｃ－５－ｓ??Ｃｏｕｒｔｓ?？ｔ）?Ｍ？ｗ！０－Ｃｈ？ｉｇｏ?＇ｒｒ＇ｌｉ??Ｒ．Ｔｉｎｉｅ（ｍｉｎ）??图６．?ＨＰＬＣ－ＭＳ下
【参考文献】

相关期刊论文 前6条

1 郑红燕;饶凯敏;姜英;杨光涛;陈曦;王建书;汪倩;王晶;袁晶;;邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯对MCF-7细胞DNA的氧化损伤[J];癌变·畸变·突变;2012年01期

2 胡存丽;仲来福;;邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯遗传毒性研究进展[J];大连医科大学学报;2007年02期

3 王哲清;;实用高效的酰胺键形成试剂[J];中国医药工业杂志;2006年12期

4 宋晓峰;魏光辉;邓永继;陈璇;刘星;张德迎;;邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对原代培养小鼠胚胎睾丸Leydig细胞功能影响研究[J];第三军医大学学报;2006年12期

5 赵文红,厉曙光;DEHP染毒后小鼠各脏器含量的测定及其意义[J];中国卫生检验杂志;2005年03期

6 刘欣,王红,张华山;生物分析中近红外荧光探针进展[J];分析科学学报;2001年04期

本文编号：2877755