肿瘤靶向治疗是新型给药系统研究领域的一大命题,靶向系统可提高肿瘤组织的药物浓度、增强药效,同时降低毒副作用。除了使用传统的纳米靶向制剂,还可以通过生物载体实现药物的递送。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有肿瘤趋向特性的成体干细胞,在细胞治疗、组织再生和免疫治疗等方面有广泛的应用。将MSCs作为药物载体,可实现肿瘤的靶向治疗。本文以MSCs与肿瘤细胞表面共表达受体CD44为着眼点,合成了透明质酸-b-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(HA-b-PLGA)聚合物,以该聚合物作为载体,制备了载有紫杉醇(Paclitaxel,PTX)的PTX-HA-PLGA胶束。通过细胞内吞方式将胶束载入MSCs中,构建出嵌有载药胶束的MSCs生物靶向系统(MSCs-Micelles)。该系统通过CD44介导的内吞增加了MSCs的载药量,同时胶束包裹避免了药物与MSCs的直接接触,降低PTX对MSCs的毒性,维持了 MSCs的肿瘤归巢能力。脑对侧半球注射后,在脑胶质瘤区域可观察到MSCs和药物的广泛分布。通过增加PTX从MSCs中释放的总量和释放时间,MSCs-Micelles提高了递送至肿瘤细胞内药物的浓度,增强了抗肿瘤活性,显著延长了脑胶质瘤原位移植模型大鼠的生存期。为了制备聚合物胶束,本文首先合成了三种不同分子量的HA-b-PLGA502H聚合物(HA分子量分别为5.8,6.7,9.1 kDa)。通过还原胺化法在HA末端连接1,4-丁二胺,使其与PLGA琥珀酰亚胺酯反应缩合生成HA-b-PLGA聚合物,使用1H-NMR和GPC对聚合物进行结构确证。采用芘荧光探针光谱法测定HA-b-PLGA 聚合物的 临界胶束浓度(Critical micelle concentration,CMC)。结果表明CMC值随着HA分子量的增大而增大,HA5.8k-b-PLGA,HA6.7k-b-PLGA和HA9.1k-b-PLGA 对应的 CMC 分别是 1.42 mg/L,2.08 mg/L和 2.84 mg/L。采用溶剂-透析法制备HA-PLGA空白胶束,胶束粒径随HA分子量增加而变大,zeta电位均保持在-15.0 mV～-16.0 mV之间。本文选用具有小粒径且低CMC值的HA5.8k-b-PLGA502H 制备 PTX-HA-PLGA 胶束,用于后续的 MSCs-Micelles 系统的构建。为获得较高的包封率和载药量,我们对聚合物浓度和PTX/聚合物比例进行筛选,最终确定以2mg/mL的共聚物浓度,PTX/聚合物比例为1:20的最优处方来制备PTX-HA-PLGA胶束。透射电镜(TEM)可观察到聚合物胶束经典的核-壳结构,采用HPLC测定其包封率达53.64 ±1.08%,载药量为2.57 ±0.03%。体外释放实验表明胶束具有缓释效果,3天可累积释放超过50%。MTT法考察载药胶束对MSCs和大鼠C6脑胶质瘤细胞的细胞毒性。结果表明两种细胞对PTX的敏感性存在显著差异,HA-PLGA-PTX胶束对MSCs的IC50(1226.81 ± 20.53 ng/mL)显著高于 C6 细胞(3.8 ± 0.14 ng/mL),两者相差300多倍,有利于MSCs在安全范围内携载和递送药物至C6细胞,并产生抗肿瘤活性。与PTX溶液组相比,胶束包裹可有效避免MSCs与PTX的接触,增加了 MSCs对PTX的耐受性,有利于提高MSCs的载药量。以6-香豆素作为荧光探针,对MSCs的胶束摄取情况和摄取机制进行考察。饱和摄取及内吞抑制实验表明MSCs通过CD44介导的内吞提高对胶束的摄取,并通过网格蛋白介导和小窝蛋白依赖性的内吞途径参与内化过程。本文考察了与不同浓度的载药胶束孵育后,MSCs细胞周期和体外细胞迁移能力的变化。实验发现,在中剂量组,MSCs分别在撤药3天和5天后恢复细胞迁移能力和细胞周期,确定MSCs与8 ng/mL载药胶束孵育8小时用于后续MSCs-Micelles的构建,该生物系统载药量为1.3 pgPTX/cell。随后我们对MSCs-Micelles的体外释放行为进行了评价。结果表明MSCs释放药物呈先快后慢的双相释放过程。前6小时释放快速,而后速度变慢,5天内可持续释出药物。约25%、40%和62%的PTX可分别从 MSCs-PTX,MSCs-NPs 和 MSCs-Micelles 释放,5 天释放总量为 0.232 pg/cell,0.379 pg/cell 和 0.792 pg/cell。相比于 MSCs-PTX,MSCs-Micelles 有利于提高药物释放量。为考察MSCs-Micelles释放的药物是否能够被C6有效摄取,并产生抗肿瘤作用,我们进行了 Transwell系统中C6细胞对PTX的摄取动力学及细胞毒性实验。MSCs-NPs和MSCs-Micelles组下室C6细胞内PTX量分别为0.03688 ±0.00034 pg/cell 和 0.04825 ± 0.00042 pg/cell,胶束组是纳米粒组的 1.3 倍。MSCs-Micelles对C6有显著的抗肿瘤活性,其作用呈药物剂量和MSCs细胞数依赖关系。通过与8ng/mLPTX-HA-PTX胶束孵育构建MSCs-Micelles,MSCs-Micelles与肿瘤细胞比例为1:5时,C6细胞存活率为50%。在3D肿瘤球模型上,我们分别对MSCs和所负载药物的肿瘤球渗透能力和肿瘤球活力进行测定。结果显示,在肿瘤球边缘和内部均能够看到MSCs,说明载药MSCs不仅能够向肿瘤迁移,并且还能够向肿瘤内部渗透。经HA修饰后,MSCs-Micelles表现出更深的渗透。采用台盼蓝染色法对3D瘤体活力进行评价,结果表明MSCs-Micelles可诱导肿瘤球细胞凋亡,效果呈剂量和MSCs数量依赖。最后,我们在大鼠原位脑胶质瘤模型上通过脑半球对侧给药方式研究了MSCs-Micelles体内靶向效果和抗胶质瘤活性。制备了载有Oregon Green(?)488荧光PTX(PTX-Flu)的载药胶束,并将其嵌载于MSCs,并对MSCs进行CM-Dil标记,观察MSCs-Micelles的脑内分布情况。MSCs注射2天后,可在肿瘤区域发现大量、散在分布的MSCs。而在注射部位只有少量MSCs成簇分布,证明了 MSCs-Micelles体内对C6脑胶质瘤的归巢能力。同时,在肿瘤部位可观察到大量的药物绿色荧光,通过共定位实验发现,大部分PTX-Flu已被MSCs-Micelles释放。抗胶质瘤实验中,脑半球对侧单次注射(1 μg/kgPTX)后,MSC-Micelles组的大鼠在意识或运动反应方面没有明显的异常,生存期显著高于其他实验组。Saline组、MSCs组、PTX-HA-PLGA组、MSCs-PTX组、MSC-NPs组和MSC-Micelles治疗组中位生存时间分别是14.5天、13.5天、22.5天、23.5天、38.5天和60天。对脑组织进行HE染色后发现经Saline和MSCs空白组处理后均显示出大片肿瘤组织,肿瘤占位明显。PTX治疗组均表现出明显的肿瘤细胞坏死或凋亡。而在MSCs-Micelles组中胶质瘤区域的最显著减少,无明显肿瘤组织可见。综上结果表明所构建的MSCs-Micelles生物靶向系统在体内可发挥显著的抗肿瘤作用。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R943;R965
【部分图文】：
本文通过丁二胺将ＨＡ连接到ＰＬＧＡ末端上，该方法操作简单，效率高。??将丁二胺化的ＨＡ与ＰＬＧＡ－ＮＨＳ缩合，形成以ＰＬＧＡ为疏水端，ＨＡ为亲水端??的ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ嵌段共聚物（图１．１）。??Ａ擊。傅??ＨＡ??ＣＯＯＨ?ＣＨｊＯＨ?ＣＯＯＨ?ＣＨｊＯＭ??ＯＨ?ＮＨＣＯＣＨ３?ＯＨＪ＾?ＮＨＣＣＴＣＨａ??ａｍｉｍｉｔｒｄ?ＨＡ??〇?〇〇??ＰＬＧＡ?ＰＬＧＡ＞ＮＩＩＳ??＋??＊ｍｉｉＭｆｒｄ?ＨＡ??Ｎ．Ｎ－ｄｍ〇ｆｉｆａｐｙｌｃｉｈｙｉ？ｎｍｅ??ＣＯＯＨ?ＣＨ，ＯＨ?ＣＯＯＨ?ＣＨｊＯＨ??ＯＨ?ＮＨＣＯＣＨｊ?ＯＨ?ＮＨＣＯ＾＾ｊ?〇??ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ??图１．１?ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物合成步骤（Ａ）?丁二胺化ＨＡ的合成（Ｂ）?ＰＬＧＡ－??ＮＨＳ与丁二胺化ＨＡ缩合形成ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物??８??
观察到?ＰＬＧＡ?的特征峰：１．４６?ｐｐｍ?（３Ｈ，－ＣＨ３）、５．２５?ｐｐｍ?（２Ｈ，－０ＣＨ２－Ｃ＝０）??和４．９１?ｐｐｍ?（?－ＣＨ－）。当ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物溶解在ＤＭＳＯ－ｄ６中时，谱图上同??时出现ＰＬＧＡ和ＨＡ的特征峰（图１．２ｃ４－ｃ５，ｃｌ－ｃ３）。而当ＰＬＧＡ－ｂ－ＨＡ聚合物??９??
?第１章载药胶束的制备及表征??溶解在Ｄ２０时，谱图上只出现ＨＡ的特征峰（图１．２ｄ４－ｄ５），而不再检测到??ＰＬＧＡ的质子信号，这是由于ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ在水中形成核－壳胶束结构，其??ＰＬＧＡ核被屏蔽。然而当共聚物溶解在ＤＭＳＯ－ｄ６中时，由于ＰＬＧＡ链被完全拉??伸，故ＨＡ和ＰＬＧＡ都可以看到信号。??采用ＧＰＣ测定得到ＰＬＧＡ与ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物的重均分子量，分别为??１９４８０?ｇ／ｍｏｌ与２３８５１?ｇ／ｍｏｌ，经ＨＡ嵌段后的聚合物与ＰＬＧＡ相差的量（４３７１??ｇ／ｍｏｌ）与增加的ＨＡ的分子量（５７６３?ｇ／ｍｏ］）基本相近。??综上，Ｗ－ＮＭＲ和ＧＰＣ结果表明ＨＡ被成功偶联到ＰＬＧＡ上。??随后，为进一步考察不同分子量的ＨＡ－ｂ－ＰＬＧＡ聚合物对ＣＭＣ的影响，本??实验中采用芘荧光探针法
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本文编号：
2877889
