靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的蛋白降解靶向嵌合体设计、合成以及生物活性研究

发布时间：2020-11-10 15:02

　　 蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)是一种双功能杂合化合物,一边用来结合靶蛋白,另一边用来结合E3连接酶,使得目标蛋白可以与E3连接酶结合,促进靶蛋白泛素化并被蛋白酶体降解。实验结果表明:与传统蛋白抑制剂相比较,PROTAC在治疗学的发展中具有广阔的前景。最新研究证明沙利度胺及其衍生物可以结合到CRBN蛋白上,CRBN能与损伤DNA结合蛋白1(damaged DNA binding protein 1,DDB1)、Cullin-4A(CUL4A)、Cullins1调控子(Roc1)结合起来,形成E3泛素连接酶复合物CRL4。该复合物可利用泛素化来标记特定蛋白,随后水解靶向蛋白。BI2536为PLK1(IC_(50):0.83 nM)和BRD4(IC_(50):25 nM)双靶点蛋白酶抑制剂,并且其构效关系研究证明其酰胺键连接部位为可改造部位。因此本论文以BI2536及其衍生物作为靶蛋白配体,可与PLK1、BRD4结合,沙利度胺类似物作为E3连接酶配体,可与E3连接酶进行结合,选用不同长度和类型的连接体将两者进行连接,设计合成PROTAC BP系列化合物。并通过对化合物PLK1和BRD4蛋白抑制活性,人肺癌细胞A549和人髓性单核细胞白血病细胞MV4-11细胞增殖抑制活性考察,并筛选出化合物BP-3以及对其MV4-11细胞凋亡的影响,对MV4-11胞中BRD4和PLK1蛋白降解能力和C-Myc蛋白表达进行了考察,对化合物BP-3抗肿瘤作用机制进行研究。同时对其在大鼠中的药代动力学特征进行了研究。用ELISA方法验证化合物对PLK1和BRD4蛋白抑制活性,实验结果表明合成的PROTAC BP系列化合物都呈现很好的BRD4和PLK1蛋白抑制活性。构效关系表明当化合物R结构为苄溴基,BI2536衍生物与沙利度胺类似物连接体为PEG且n=3时,对BRD4和PLK1蛋白抑制活性(BRD4:IC_(50)=12.3 nM;PLK1:IC_(50)=8.9 nM)最强,当连接体长度增加或替换为烷基链时对BRD4和PLK1蛋白抑制活性下降。CCK8法进行细胞实验结果表明,合成的PROTAC BP系列化合物都呈现很好的对人肺癌细胞A549和人髓性单核细胞白血病细胞MV4-11细胞增殖抑制活性。其中化合物BP-2,BP-3和BP-4细胞增殖抑制活性都要优于对照化合物BI2536。其中化合物BP-3对A549(IC_(50)=10.8 nM)和MV4-11(IC_(50)=7.6 nM)增殖抑制活性最强。流式细胞术检测BI2536和化合物BP-3作用MV4-11 24 h后细胞凋亡率结果表明,0、50、100 nM,化合物BP-3诱导MV4-11细胞凋亡率分别为6.2%、26.3%、33.3%。证明化合物BP-3可诱导MV4-11细胞凋亡,且促MV4-11细胞凋亡活性要明显优于对照品BI2536。对MV4-11细胞周期影响研究显示,化合物BP-3使细胞周期阻滞在G0/G1期,BI2536细胞周期阻滞在G2/M期。MV4-11细胞凋亡相关蛋白表达检测证明,化合物BP-3诱导MV4-11细胞凋亡可能通过PARP裂解,caspase-3活化和Bcl-2下调有关。Western-blot实验结果表明化合物BP-3在20-30 nM浓度可以将BRD4蛋白完全降解;在40-50 nM浓度将PLK1蛋白降解,并且可降低BRD4下游通路中C-Myc蛋白的表达,在40-50 nM浓度C-Myc蛋白表达消失。证明化合物BP-3具有BRD4和PLK1蛋白降解能力,并且因降解BRD4蛋白使下游通道C-Myc蛋白表达减少并消失,并且其蛋白降解能力呈剂量依赖关系。化合物BP-3在50 nM浓度下与MV4-11细胞转染12h就可引起BRD4和PLK1明显降解。证明化合物BP-3对MV4-11细胞中BRD4和PLK1蛋白具有强效、快速的降解能力。MV4-11细胞移植SCID小鼠体内实验证明,化合物BP-3,BI2536都能明显抑制肿瘤的增长,但相同剂量下化合物BP-3抑制效果要优于BI2536。同时肿瘤组织BRD4,PLK1和C-Myc蛋白表达显示,化合物BP-3可通过使PLK1和BRD4蛋白降解,并降低C-Myc蛋白表达来达到抑制肿瘤生长作用。同时本论文对化合物BP-3大鼠体内药代动力学进行了研究,建立了应用高效液相色谱法(HPLC)测定化合物BP-3血药浓度的方法,结果表明,该方法专属性高,精密度、准确度良好,血浆样品处理采用沉淀法,操作简单,能够满足化合物BP-3的药代动力学研究。通过体外体内生物活性实验证明,本论文设计合成的化合物BP-3可快速、有效的降解BRD4和PLK1蛋白,并使C-Myc蛋白表达降低,同时具有很好的肿瘤生长抑制能力。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R914;R96
【部分图文】：

TX2-121-1 TX2-135-2 TX2-120-1图 2 疏水标记（HyT）技术开发的化合物结构1.2.3 蛋白降解靶向嵌合体技术PROTACs 是由靶蛋白配体、连接体、E3 连接酶配体三部分组成的一个化物分子。连接体将这两个配体连接起来，其中靶蛋白配体与靶蛋白产生相互作用E3 连接酶配体可与 E3 连接酶相结合。因此，PROTAC 在与其 E3 连接酶和靶白结合时形成三元复合物。通过连接 E3 连接酶，PROTAC 将 POI 置于空间有的位置以促进底物泛素化，从而选择性地降解靶蛋白（图 2）[43]。这种方法与小分子抑制剂相比，有很多优点。第一，在理论上来说，小分抑制剂与靶蛋白结合后理应抑制其活性，例如，恩扎鲁胺可与雄激素受体结合

（ErBb2PPPI3K），以在生长因子刺激时诱导 PI3K 的条件性敲低 9（图 3）。类似于早期的 PROTAC，该降解分子由 VHL 肽结合片段和多聚-D- ARG 序列组成，以增强细胞通透性。然而，磷酸 PROTAC 不是用一个小分子配体来募集靶蛋白，而是使用“条件性”蛋白质配体，即仅在向细胞添加生长因子时才结合其同源伴侣的蛋白质配体。这是通过结合来自受体酪氨酸激酶（例如，ErBb3）的肽序列来实现的，所述受体酪氨酸激酶含有磷酸化位点，其用作下游信号传导组分（例如，PI3K）的结合位点。在概念验证实验中，生长因子神经调节蛋白诱导磷酸PROTAC 的 ErBb3 和 ErBb3 磷酸化位点，从而导致 PI3K 的募集、泛素化和蛋白酶体介导的降解。此外，在小鼠异种移植模型中，ErBb2PPPI3K 的治疗导致肿瘤大小减少 40%[54]，首次证明了 PROTAC 的体内活性。尽管在降解靶蛋白方面效果显著，也有较好的体内抗肿瘤活性，但其分子量高、细胞通透性差、潜在的代谢不稳定性等特性使得 PROTAC 不太可能成为良好的候选药物。

1.2.3.2.3 VHL 蛋白作为 E3 泛素连接酶第一个广泛应用于小分子选择性靶蛋白降解的E3连接酶是Cli-RING泛素连接酶（CRL）组分 VHL（图 5）。通过基于经典片段的方法开发基于羟脯氨酸的HIF1 衍生的 VHL 结合肽的小分子模拟物，实现了这一突破。该蛋白为 E3 泛素连接酶复合体Elongin B/C-CUL2-VHL的组成部分。VHL可以使缺氧诱导因子-1α（HIF1α）泛素化导致 HIF1α 的降解。2012 年 Buckley 等人发表了第一个抑制VHL-HIF1α 相互作用的小分子化合物，该 VHL 配体可与 VHL 中 HIF1α 识别位点偶联，结果显示该 PROTAC 在 100 nm（DC50）下可诱导其靶蛋白 50%的降解。重要的是，这种 PROTAC 被证明在体内是有活性的;在使用 PROTAC 治疗之后，小鼠心脏，肾脏和 MDA-MB-231 异种移植肿瘤的 ERRα 水平分别降低了约 44%、44%和 39%[47]。因此该设计被广泛应用于 PROTAC 的设计中，研究发现此类PROTAC 可同时降解丝氨酸/苏氨酸激酶 RIPK2。
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本文编号：2878065