基于多参数高内涵筛选的早期药物肝毒性研究

发布时间：2020-11-15 07:00

　　 药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是一种常见药物不良反应,是导致药物研发失败和从市场撤回的主要原因。根据研究表明传统的药物肝毒性评价主要通过动物实验实现,但由于大量使用动物、耗费时间长、费用高、灵敏度低及物种差异性等导致现有的动物模型并不能很好的评价人体的肝损伤。而随着现代对药物肝毒性作用机制的深入了解,基于“毒性通路”与“毒性作用机制”的毒理学替代法应运而生,用体外细胞实验代替动物实验已成为药物肝毒性预测的重要方向。在2007年美国国家研究理事会(NRC,The US National Research Council)正式发布的“21世纪的毒性试验:远景与策略”报告中提出:基于“毒性通路”的药物毒性预测是外源化学物质进入体内将引发分子起始事件(molecular initiate event,MIE),扰动毒性通路,导致一系列生物组织(包括细胞、亚细胞、组织器官等)产生不良反应结果。通过体外细胞水平实验,将药物扰动毒性通路的剂量和毒性效应关联起来,可实现对药物安全性较为全面的评估。而高内涵细胞成像分析技术在替代毒理学中的应用正好为这一思路提供了极大的辅助作用。HCS是利用荧光显微镜成像自动化,对细胞形态及其中荧光靶点的荧光强度与分布,进行自动化的定量和定位分析,获得的药物毒性检测数据,可做出药物毒性的剂量-效应曲线,分析出药物引起的早期细胞毒性的剂量,从而实现对药物潜在毒性更为精确的预测。本研究是以HepG2细胞为模型,根据药物作用机制从多种药物中筛选6种代表性的药物:紫杉醇、鬼臼毒素、顺铂、5-氟尿嘧啶及常用于肝损伤模型建立的CCl_4饱和溶液和药物的分散乳化剂的表面活性剂SDS为研究对象,用MTT测其IC_(50)值,并以IC_(50)值为参考(CCl_4其100%饱和溶液为参考),取其100%、75%、50%、25%、10%的5个浓度梯度作用细胞1h、2h、4h、24h,然后采用HCS结合荧光标记技术检测药物直接作用细胞引起的相关指标的变化(如:细胞数量、DNA含量、钙稳态、ROS、线粒体膜电位、细胞膜通透性等),并综合分析各个指标建立分析方法,结果表明紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶、SDS对HepG2细胞的的肝细胞毒性为细胞膜的完整性受损导致的;鬼臼毒素则是由于钙离子浓度升高导致钙稳态失衡引起的;CCl_4细胞毒性则是由ROS引起,并建立HCS检测早期药物肝毒性的方法。本研究根据紫杉醇和鬼臼毒素抗肿瘤的作用机制,从与其机制相同的多种药物筛选出两种药物分别为秋水仙碱和依托泊苷,采用同样HCS方法检测药物直接作用细胞引起的相关指标的变化,并对已建立的HCS分析方法进行验证。结果显示秋水仙碱表现出与紫杉醇相同毒性作用,依托泊苷同样也表现出相同的毒性作用,表明HCS检测药物早期肝毒性的方法可行性。本研究利用已经建立的HCS检测早期肝毒性的方法对中药的早期肝毒性进行研究,从具有肝毒性中药中选出两种不同成分中药单体分别为薯蓣皂苷和泽泻醇B,通过HCS检测其早期肝毒性结果显示泽泻醇B和薯蓣皂苷对HepG2细胞毒性为氧化应激导致的,并推测氧化应激与铁凋亡有关。本实验研究是以炮制后熟三七中的人参总皂苷和人参皂苷单体为研究对象,测其细胞毒性,研究炮制时间对细胞毒性的影响。结果显示:炮制后人参总皂苷的颜色和组成成分发生变化,炮制时间与组成成分含量及细胞毒性成正相关(P0.001);表明生三七不能过度炮制,炮制时间超过9h后表现一定毒副作用,人参总皂苷和人参皂苷单体表现出一定细胞毒性,并具有潜在的肝毒性。综上所述,利用HCS检测方法可以多参数、多指标、快速、高通量的检测药物早期肝毒性,比现有方法的灵敏度和特异性高,增加了安全性,降低了实验成本,并且填补HCS在检测天然化合物方面的空白,扩大HCS应用领域。
【学位单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

图 2.1 5 种荧光探针所对应的荧光图片Figure 2.1 Fluorescent images corresponding to five fluorescent probes表 2.1：检测药物肝毒性所使用的荧光探针表 2.1 Fluorescent probes for detecting liver toxicity of drugsFluorescentprobeDetectionindexWavelengthChannel（nm）Color Finalconcentration(μM)TimeHoechst33342 Cell numberDNA IntensityNuclear area361/486 Blue 4Fluo.4 Ca45min2+Cell area494/516 Green 2TMRM MMP 549/576 Orane 1

2.5.2.1 紫杉醇早期肝毒性分析结果如图2.2-A所示，不同浓度紫杉醇作用HepG2细胞后，在浓度2.5nM、6.25nM（10%IC50、25%IC50）时，作用细胞 1h、2h、4h、24h 后细胞的 6 个毒性指标没有发生显著变化；在 12.5nM (50%IC50) 浓度时，4h 表现为细胞膜通透性开始发生改变，24h 时回复正常水平，随后线粒体膜电位 24h 时表现为降低，其他毒性指标随时间增加没有显著变化；在 18.75nM (75%IC50)浓度时

昆明理工大学硕士学位论文根据鬼臼毒素抗肿瘤的作用机制，其作为 DNA 拓扑酶抑制剂抑制 DNA 解旋，引起 DNA 含量的减少，从而引起细胞的凋亡，HCS 检测的 DNA 含量的变化（实验中 DNA 含量增加原因可能是药物导致细胞核皱缩引起 DNA 聚集，使得荧光强度增加，从而）验证了这一结论。而鬼臼毒素对 HepG2 细胞毒性作用可能是由细胞内钙离子浓度变化，使钙稳态失衡导致的。
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 武双;郭从亮;崔秀明;杨晓艳;;HPLC法同时测定生三七和蒸制三七中10种皂苷类成分的含量[J];中药材;2015年08期

2 陈斌;许慧琳;贾晓斌;;三七炮制的研究进展与研究思路[J];中草药;2013年04期

3 刘利波;王莉莉;;高内涵分析在新药发现毒理学中的应用进展[J];中国药理学与毒理学杂志;2012年06期

4 郭家彬;彭辉;王以美;彭双清;;线粒体毒性评价及其在创新药物安全性评价中的意义[J];中国新药杂志;2012年16期

5 陈静;陶雪芬;应华洲;;微管蛋白秋水仙碱位点抑制剂研究进展[J];中国现代应用药学;2011年09期

6 王亚茹;邓高松;李云;姜金仲;孙宇涵;;秋水仙碱对微管蛋白的作用机制及其细胞效应研究进展[J];西北植物学报;2010年12期

7 程春旭;高颜茹;;抗肿瘤药物作用机制的研究进展[J];吉林医学;2009年23期

8 蒋宇宁;付玲;李茜;;秋水仙提取工艺的研究[J];新疆中医药;2007年06期

9 张瑞芬;赵晶;;痛风的药物治疗现状及展望[J];解放军药学学报;2007年06期

10 袁理春;徐中志;赵琪;吕丽芬;杨丽云;陈翠;周敏;周志宏;胥勇;杨永红;;丽江山慈姑秋水仙碱HPLC测定[J];西南农业学报;2007年01期

相关博士学位论文 前1条

1 翁成国;有毒中药的传统药性特征研究[D];南京中医药大学;2014年

相关硕士学位论文 前1条

1 杜玉芝;依托泊苷植入剂治疗小鼠Lewis肺癌的药效学研究[D];合肥工业大学;2017年

本文编号：2884482