法米替尼靶点的再发现及体内代谢物与疗效和不良反应的相关性研究

发布时间：2020-11-17 23:18

　　 研究背景与目的法米替尼是我国自主研发的1.1类新药,也是一个多靶点的酪氨酸激酶抑制剂,对多种实体瘤均有较好的疗效。然而,在其临床应用中仍存在着以下问题:(1)临床前实验表明法米替尼对中国非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者突变率较高的驱动基因表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)无抑制效果,而临床试验显示其对EGFR野生型的患者有较好的疗效,表明法米替尼的抗肿瘤机制尚不明确,仍需进一步验证;(2)法米替尼对转移性肾癌有较好的疗效,但临床上尚未找到与肾癌治疗相关的特异性较强的生物标志物,仍需对法米替尼的临床效应相关因素进行探索。综上,进一步探索法米替尼的作用靶点及作用机制,对推动法米替尼个体化用药具有重要意义。本课题组前期基于激酶酶谱筛查平台,检测了法米替尼对275个蛋白激酶的抑制率,并结合各激酶在肿瘤中的意义,初步确定了棘皮动物微管结合样蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(Echinoderm microtubule-associated protein-like4-Anaplastic Lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因的突变蛋白为其潜在靶点。因此,本课题将具有该遗传背景的NSCLC细胞株NCI-H2228为主要研究对象,在细胞水平及动物水平对该靶点进行相关验证,并初步阐明法米替尼作用机制。此外,本研究还将检测临床患者的血药浓度,综合临床基本信息考察法米替尼疗效及不良反应的相关性因素,为法米替尼的个体化给药提供科学依据。实验方法与结果1.以克唑替尼为阳性对照药,用CCK-8(Cell counting kit-8)法检测法米替尼对NCI-H2228细胞的增殖抑制活性,同时考察法米替尼对该细胞凋亡、周期和迁移的影响。结果显示,法米替尼对EML4-ALK融合基因突变的NSCLC细胞具有较好的活性抑制作用,且20nM法米替尼处理48 h后的NCI-H2228细胞与空白对照组相比,能使NCI-H2228细胞凋亡率显著增加且周期阻滞在G0/G1期,同时法米替尼还能抑制其迁移,提示法米替尼具有抑制EML4-ALK突变的NSCLC增殖及促进凋亡的能力。2.分别用不同浓度法米替尼(5,10,20nM)处理NCI-H2228细胞48h后,采用免疫印迹法(Western blotting,WB)分析细胞中ALK及其下游蛋白的磷酸化水平。结果显示,法米替尼能够显著抑制ALK及其下游蛋白的磷酸化并促进凋亡相关蛋白的上调且呈剂量依赖性,提示法米替尼抑制NCI-H2228细胞活性可能与ALK/Akt/ERK/STAT3通路抑制有关。3.采用裸鼠皮下接种NCI-H2228细胞,建立体内相应的荷瘤模型,以克唑替尼(100mg/kg·d)为阳性对照,观察给药后不同剂量下法米替尼组(2.5,5,10,20mg/kg·d)的体内抑瘤效果。结果显示,与空白对照组相比,克唑替尼和法米替尼中高剂量均能显著性地抑制肿瘤生长(P0.01),表明法米替尼也可能对EML4-ALK突变的NSCLC生长具有良好的抑制作用,且呈剂量依赖的趋势。但后期克唑替尼和法米替尼均产生耐药情况,高剂量组法米替尼的效果优于克唑替尼,表明后期仍需进一步开展法米替尼对EML4-ALK二次突变耐药的相关研究。4.建立超高效液相色谱串联质谱(Ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass,UHPLC-MS/MS)方法同时检测人体血浆中法米替尼原型及主要代谢产物(M3、M7、M9-1和M9-5)并对临床晚期肾癌的患者进行血药浓度检测,结合临床患者的基本信息,疗效及不良反应发生情况进行法米替尼疗效及不良反应的相关性分析,结果表明法米替尼原型(M0)的血药浓度与患者的获益率相关(P0.05),法米替尼代谢产物M3的血药浓度与与转移灶累及器官数相关(P0.05),法米替尼代谢产物M9-1与手足综合征的发生率相关(P0.05)。结论首次发现并验证了法米替尼在细胞水平对EML4-ALK融合基因突变的NSCLC细胞具有显著的抑制作用,初步阐明了法米替尼抑制EML4-ALK突变的NSCLC细胞的可能作用机制,即抑制ALK/Akt/ERK/STAT3肿瘤调控通路。通过体内实验进一步证实了法米替尼对其活性的抑制效果,后期还可围绕法米替尼开展EML4-ALK二次突变导致耐药的相关研究。本实验中所建立的UHPLC-MS/MS方法可成功应用于临床样本的检测,并对晚期肾癌患者进行了血药浓度的检测,首次将其与疗效及不良反应进行了相关性分析,结果表明法米替尼原型及代谢产物可能与疗效及不良反应发生率相关,但后期仍需进一步考察验证。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R965
【部分图文】：

学硕士学位论文异性分析性分析通过 SPSS 21.0 进行处理，对凋亡率的比较采用 t 检验，P＜0.著性差异，P＜0.01 时认为有非常显著差异。、 实验结果） IC50值分析算（图 1-1），法米替尼与克唑替尼对 NCI-H2228 肿瘤细胞的 IC50值 和 26.8 nM，说明法米替尼对 EML4-ALK 突变的细胞也有较好的抑

图 1-2. 法米替尼对 NCI-H2228 细胞凋亡的抑制作用（n=3）左图为给药后细胞凋亡数,其中右上、右下象限分别为后期凋亡和早期凋亡细胞比例；右图法米替尼处理 48h 后细胞的凋亡率**比 P＜0.01（VS 空白对照组）（三） 法米替尼对 NCI-H2228 细胞周期的影响采用流式细胞仪检测法米替尼对 NCI-H2228 细胞的周期影响，结果见图 1-3。从图中可以看出，经法米替尼处理后，细胞周期变化比较显著，与对照组相比，G0/G1期细胞比例显著上升（P<0.05），比例高达 72.38%，G2 期细胞则显著下降（P<0.01），比例仅为 1.2%，说明 NCI-H2228 细胞被法米替尼阻滞在 G0/G1 期。（四） 法米替尼对 NCI-H2228 细胞迁移能力的影响通过细胞划痕实验检测法米替尼处理后 NCI-H2228 细胞的迁移能力，结果见图

图 1-3 法米替尼对 NCI-H2228 细胞周期的影响（n=3）左图为给药后细胞周期测定原始数据，右图为给药后的细胞周期分布情况，**P＜0.01（VS 空白对照组）
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本文编号：2888034