创新药物对人肝微粒体CYP450酶体外抑制评价体系的建立与应用

发布时间：2017-04-08 03:06

  本文关键词：创新药物对人肝微粒体CYP450酶体外抑制评价体系的建立与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:药物对CYP450酶的抑制作用,是引起药物相互作用的最主要因素,主要表现为药物通过对肝药酶的直接抑制,减慢合用药物在肝脏的代谢,使得后者产生疗效增强甚至毒性,进而引发不良反应。在药物开发早期阶段进行CYP450酶抑制潜能的研究,可提示临床上发生药物-药物相互作用的潜力,以开发出更为安全且有效的药物,指导临床合理、安全用药。传统的体外抑制作用研究方法主要是荧光检测结合重组酶法,该法不能应用于具有荧光干涉的药物抑制检测,且由于重组的单酶活性远高于人肝微粒体,获得的实验结果不能直接外推至人体。本文旨在建立LC-MS/MS法测定CYP450酶特异性底物相应的代谢产物的生成量,以人肝微粒体模型为研究对象,针对酶抑制评价体系的若干环节开展研究,优化、建立一套合理、准确、可靠的体外评价体系,并将该体系应用于创新药物对人肝微粒体七种CYP450酶的抑制作用评价,以预测其在体内可能引起的药物相互作用,为进一步临床研究提供有价值的信息。方法:建立测定CYP450酶特异性底物对应的代谢产物对乙酰氨基酚(CYP1A2)、4-羟基美芬妥因(CYP2C19)、1-羟基丁呋洛尔(CYP2D6)、1-羟基咪达唑仑(CYP3A4)、羟基安非他酮(CYP2B6)、去乙基阿莫地喹(CYP2C8)、4-羟基双氯芬酸(CYP2C9)的LC-MS/MS定量分析方法,并对该法进行全面的方法学验证,包括选择性/特异性、进样残留情况、内标与待测物相互干扰、线性范围与定量下限、准确度和精密度、基质效应、提取回收率、稳定性、稀释效应等。分别以非那西丁/美芬妥因/丁呋洛尔/咪达唑仑/安非他酮/阿莫地喹/双氯芬酸作为CYP450酶(CYP1A2/CYP2C19/CYP2D6/CYP3A4/CYP2B6/CYP2C8/CYP2C9)的特异性底物建立人肝微粒体CYP450酶抑制作用的体外评价体系,以其对应的代谢产物的浓度表征相应的CYP450酶的活性,通过对七个阳性抑制剂(呋拉茶碱/噻氯匹定/奎尼丁/酮康唑/噻氯匹定/二甲苯氧庚酸/磺胺苯吡唑)的CYP450酶抑制潜能的考察,验证该体系的可靠性。将该体系应用于三个创新药物对人肝微粒体七种CYP450酶抑制潜能的评价研究,预测其在体内可能引起的药物相互作用。结果:建立的测定人肝微粒体七种CYP450酶特异性底物的代谢产物的LC-MS/MS分析方法特异性良好,肝微粒体基质中各代谢产物在各自的浓度范围内线性关系良好(r0.99),最低定量限分别为50/10/10/50/10/50/20 nM(CYP1A2/CYP2C19/CYP2D6/CYP3A4/CYP2B6/CYP2C8/CYP2C9),各代谢产物在低、中、高三个浓度水平的准确度(RE)介于-3.20~8.22%之间,批内、批间精密度(RSD)分别为1.84~10.2%和0.900~14.9%。评价体系中七种阳性抑制剂对各自的CYP450酶均有显著抑制作用,测得IC50与FDA参考值相当。应用该评价体系评价三个创新药物对人肝微粒体七种CYP450酶抑制作用,结果显示,候选药B对CYP2D6的IC50为21.7μM,其余的IC50均大于30μM。结论:本研究建立的LC-MS/MS定量分析方法灵敏、快速、特异、可靠,可同时准确定量分析孵育体系中七种CYP450酶探针底物对应代谢产物的浓度。评价体系中七种CYP450酶的阳性抑制剂均对各自的CYP450酶均有显著抑制作用,表明该评价体系准确可靠。应用该体系评价了三个创新药物(A、B、C)对人肝微粒体七种CYP450酶抑制作用,结果显示,除候选药B对CYP2D6表现出一定的抑制作用(IC50为21.7μM)外,候选药物A、C对CYP450酶抑制的IC50均大于30μM,提示三个候选药物对CYP450酶的活性产生抑制作用的可能性较低。本研究建立的肝微粒体评价体系可成功应用于评价创新药物对人肝微粒体七种CYP450酶抑制作用研究。
【关键词】：CYP450 酶 肝微粒体 抑制作用 LC-MS/MS 评价体系
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R969
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、基于LC-MS/MS技术测定人肝微粒体七种CYP450酶代谢产物的分析方法建立与验证16-41
• 1.1 实验材料16-18
• 1.1.1 仪器16-17
• 1.1.2 药品及试剂17
• 1.1.3 溶液配制17-18
• 1.2 实验方法18-20
• 1.2.1 LC-MS/MS分析条件18-19
• 1.2.2 生物样品处理方法19-20
• 1.2.3 数据计算20
• 1.2.4 方法验证20
• 1.3 实验结果20-37
• 1.3.1 系统适应性20-22
• 1.3.2 选择性/特异性22-24
• 1.3.3 进样残留情况24-25
• 1.3.4 内标与待测物及待测物之间相互干扰25-28
• 1.3.5 线性范围28-29
• 1.3.6 定量下限29-30
• 1.3.7 准确度和精密度30-31
• 1.3.8 基质效应31-33
• 1.3.9 提取回收率33-34
• 1.3.10 稳定性34-36
• 1.3.11 稀释效应36-37
• 1.4 讨论37-39
• 1.4.1 色谱条件优化38-39
• 1.4.2 质谱条件优化39
• 1.5 实验小结39-41
• 二、药物对人肝微粒体CYP450酶抑制作用研究体系的建立41-55
• 2.1 实验材料41-43
• 2.1.1 仪器41-42
• 2.1.2 药品42
• 2.1.3 试剂42-43
• 2.2 实验方法43-47
• 2.2.1 溶液配制43-45
• 2.2.2 孵育试验45-47
• 2.2.3 数据处理47
• 2.3 实验结果47-49
• 2.3.1 七种阳性抑制剂存在下人肝微粒体CYP450酶底物的代谢产物的浓度47
• 2.3.2 七种阳性抑制剂对人肝微粒体CYP450酶的体外抑制47-49
• 2.4 讨论49-54
• 2.4.1 CYP1A249-50
• 2.4.2 CYP2C1950-51
• 2.4.3 CYP2D651
• 2.4.4 CYP3A451-52
• 2.4.5 CYP2B652
• 2.4.6 CYP2C852-53
• 2.4.7 CYP2C953-54
• 2.5 实验小结54-55
• 三、药物对人肝微粒体七种CYP450酶抑制作用评价体系的应用55-64
• 3.1 实验材料55-57
• 3.1.1 仪器55-56
• 3.1.2 药品56
• 3.1.3 试剂56-57
• 3.2 实验方法57-61
• 3.2.1 溶液配制57-58
• 3.2.2 孵育试验58-60
• 3.2.3 数据处理60-61
• 3.3 实验结果61-62
• 3.3.1 三个候选药物存在下人肝微粒体CYP450酶底物的代谢产物的浓度61-62
• 3.3.2 候选药物A、B、C对人肝微粒体CYP450酶的体外抑制62
• 3.4 讨论62-63
• 3.5 实验小结63-64
• 结论和展望64-65
• 参考文献65-71
• 发表论文和参加科研情况说明71-72
• 综述 酶抑制体外评价体系在新药开发初期的应用72-81
• 综述参考文献79-81
• 致谢81-82
• 个人简历82

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本文编号：291915