靶向3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）的抗癌药物发现及活性评价

发布时间：2021-01-28 23:25

　　最近在理解癌症和代谢之间关系方面的研究,突出了由三个连续的酶促反应组成的丝氨酸合成途径（SSP）的重要性。人源3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）催化SSP合成葡萄糖衍生丝氨酸的第一步,并且在多种癌细胞中显示高表达,包括乳腺癌,黑色素瘤,结肠癌,胶质瘤,鼻咽癌等。本研究应用基于酶活性的高通量筛选技术,从不同来源的天然产物中筛选得到靶向PHGDH的先导化合物,并进一步在细胞及动物水平测定其活性,建立了靶向PHGDH的天然产物（NP）抑制剂的筛选和活性评价体系。Azacoccone E,一种来自黄曲霉培养物的次生代谢产物,在体外对PHGDH表现出有效的酶抑制活性。利用微量热泳动（MST）测定和细胞热转变分析（CETSA）证实,Azacoccone E直接与PHGDH结合。并且在细胞水平证明,该化合物对PHGDH依赖性癌细胞具有选择性毒性,并能引起细胞凋亡。进一步的酶活性动力学实验,显示Azacoccone E是底物3-磷酸甘油酸（3-PG）的非竞争性抑制剂,并表现出时间依赖性抑制效果。此外,分子对接证明了Azacoccone E在PHGDH的变构位点中具有低结合能。因此,Azacoccone... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

重组质粒的构建与筛选

图 1.2 重组质粒的构建与筛选（A）目的基因 PCR 扩增，并跑琼脂糖凝胶电泳；（B）利用琼脂糖凝胶技术纯化线载体质粒，除去被限制性内切酶切除的小分子量片段；（C）PCR 技术检验重组质电泳观察目的条带在 1000 bp 偏下位置。第一泳道位置均为 DNAmarker，2-4 泳道均为副孔。PHGDH 的小量诱导表达检测PHGDH-pET28a 重组质粒导入 BL21 感受态，少量培养并检测目的蛋白的表，SDS-PAGE 凝胶显色结果显示（图 1.3），Ni-agrose 提取部分得到大量且的 34 KD 大小条带，与目的蛋白分理论分子量大小一致。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文4.3 PHGDH 的大量表达与纯化将少量检测结果显示 PHGDH 大量表达的甘油菌大量培养，先用 Ni-agrose对总蛋白进行提取，用高浓度咪唑洗脱得到的目的蛋白，然后用凝胶排阻层析柱（Superdex200）进一步分离纯化，如图 1.4A 所示，在 40mL 时有蛋白液开始流出，紫外吸收值开始上升，并在 59.1mL 位置达到最大，吸收值为 540mAU，且峰形对称性好。进一步用 SDS-PAGE 检测，凝胶显色结果显示得到纯度高且性质稳定的蛋白质，蛋白位置大小与理论值一致（图 1.4B）。


本文编号：3005882