表达融合蛋白HSA/IL-2的CHO细胞培养工艺研究

发布时间：2021-02-22 14:31

　　白介素-2（Interleukin-2,IL-2）是一种具有多功能免疫调节作用的细胞因子,由于在人体内半衰期短因此在临床应用时受到限制。本研究室前期工作中,将人血清白蛋白（HSA）与人IL-2（HSA/IL-2）融合并先后在毕赤酵母、CHO细胞两种表达体系中成功表达。毕赤酵母缺乏完善的翻译后修饰功能,蛋白糖基化形式不完全,蛋白质存在降解等问题。CHO细胞表达HSA/IL-2时在一定程度上解决了酵母表达体系的问题,且蛋白具有良好的生物活性,提高了HSA/IL-2的成药性。但CHO细胞培养存在以下问题:（1）实验室前期使用的无血清培养基和流加培养基含多种蛋白成分,培养基性质不稳定,培养基不易保藏;（2）摇瓶培养规模小,不能满足HSA/IL-2的后续研究及产业化发展。本课题将以此为出发点,筛选并优化CHO细胞的培养基体系,并探究CHO细胞在搅拌式生物反应器中的培养工艺。为解决培养基问题,考察了四种商业化无血清培养基的特性,完成细胞悬浮驯化。结合CHO细胞生长密度和活率,筛选出最优基础培养基M1。通过流加培养方式,筛选出最优流加培养基F3。通过添加蛋白水解物（酵母提取物、大豆蛋白水解物、胰蛋白... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：43 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 白介素-2 概况
        1.1.1 人白介素-2
        1.1.2 人IL-2 分子结构及其生物活性
        1.1.3 重组人IL-2 药物现状
        1.1.4 重组人IL-2 类似物的研究
        1.1.5 融合蛋白HSA/IL-2 的研究
    1.2 中国仓鼠卵巢细胞表达系统概况
        1.2.1 常用表达系统
        1.2.2 CHO细胞表达系统的优缺点
        1.2.3 CHO细胞生长方式
    1.3 哺乳动物细胞培养工艺研究
        1.3.1 细胞培养模式
        1.3.2 动物细胞生物反应器
        1.3.3 CHO细胞培养过程中参数检测及控制
    1.4 立题意义和研究内容
第二章 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 仪器设备
        2.1.4 培养基及溶液配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 CHO细胞的培养与冻存
        2.2.2 CHO细胞的悬浮驯化
        2.2.3 蛋白检测方法
        2.2.4 基础培养基及流加培养基筛选实验
        2.2.5 添加小分子促进剂的流加培养
        2.2.6 CHO细胞周期及细胞凋亡测定
        2.2.7 CHO细胞培养过程中生化指标测定
        2.2.8 搅拌式生物反应器中CHO细胞培养工艺流程
        2.2.9 Western blot检测
        2.2.10 融合蛋白生物活性检测
        2.2.11 数据的统计分析
第三章 结果与讨论
    3.1 CHO细胞无血清悬浮培养特性
        3.1.1 CHO细胞悬浮驯化培养
        3.1.2 无血清培养基筛选
        3.1.3 流加培养过程中CHO细胞生长、代谢及融合蛋白表达情况
    3.2 提高CHO细胞密度及延长细胞培养周期的培养基优化
        3.2.1 小分子添加剂对CHO细胞生长及目的蛋白表达量的影响
        3.2.2 水解物添加浓度的确定
        3.2.3 流加培养过程中水解物对CHO细胞生长及目的蛋白表达的影响
        3.2.4 酵母提取物YE对培养基渗透压影响
        3.2.5 酵母提取物YE对CHO细胞周期的影响
        3.2.6 酵母提取物YE对CHO细胞凋亡的影响
    3.3 搅拌式生物反应器中CHO细胞培养工艺研究
        3.3.1 消泡剂添加浓度筛选
        3.3.2 通气量和搅拌速率对CHO细胞生长的影响
        3.3.3 搅拌式生物反应器流加培养过程中CHO细胞生长及代谢
        3.3.4 生物反应器流加培养过程的优化
        3.3.5 融合蛋白验证
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]重组CHO细胞无血清培养基的研制[J]. 赵丽丽,刘忠,程凡亮,吴洪英.  中国生物制品学杂志. 2014(07)
[2]人血清白蛋白-血管钠肽融合蛋白在毕赤酵母中的表达[J]. 崔燕生,姜曰水,高昊,雷楗勇,钱凯,陈蕴,段作营,金坚.  工业微生物. 2014(03)
[3]pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达[J]. 刘斌,祁光宇,陈晓宇,王宇,牟克斌,黄银君,刘学荣.  甘肃农业大学学报. 2014(03)
[4]人血清白蛋白融合技术研究进展[J]. 郑炜,李杰.  长沙大学学报. 2013(05)
[5]全长PTH（1-34）-HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性[J]. 李俊毅,彭林,唐存多,邬敏辰,金坚.  中国生物制品学杂志. 2013(04)
[6]哺乳动物细胞高效表达系统研究进展[J]. 柏家林.  西北民族大学学报(自然科学版). 2013(01)
[7]人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定[J]. 李波,段作营,张红梅,雷楗勇,陈蕴,唐瑜菁,金坚,李华钟.  食品与生物技术学报. 2012(03)
[8]白介素-2治疗肾癌的护理体会[J]. 李艳,张自茹.  实用临床医药杂志. 2011(02)
[9]重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达[J]. 金光泽,段作营,张莲芬,金坚,李华钟.  食品与生物技术学报. 2010(04)
[10]共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响[J]. 屈琳,雷楗勇,张琦,丁月娣,马晓峰,陈蕴,金坚.  中国生物制品学杂志. 2010(04)

博士论文
[1]GS-CHO细胞无血清培养过程的开发与优化[D]. 范里.华东理工大学 2010

硕士论文
[1]人白介素-2和人血清白蛋白融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的表达[D]. 卢慧惠.江南大学 2015
[2]重组人促红素（CHO-rhEPO）细胞的大规模扩增培养研究[D]. 董学平.齐鲁工业大学 2012
[3]GS-CHO细胞培养工艺优化[D]. 刘美.东北农业大学 2012
[4]rIL2-HSA融合蛋白注射剂型的开发研究[D]. 罗文.江南大学 2012



本文编号：3046134