稳定表达hOCTN1/2细胞模型的构建及应用

发布时间：2021-04-03 21:06

　　目的:构建稳定表达人肉碱/有机阳离子转运体1和2（h OCTN1/h OCTN2）的细胞模型;考察抗精神病药物WY-01与h OCTN1和h OCTN2的相互作用,以及有机阳离子类转运体在WY-01肾脏跨膜转运中的作用。方法:（1）从人肾组织中提取h OCTN1和h OCTN2基因,构建获得重组质粒pc DNA3.1（+）-h OCTN1和pc DNA3.1（+）-h OCTN2,分别转染MDCK细胞,经G418抗性筛选挑取单克隆细胞株。经麦角硫因（h OCTN1经典底物）或米屈肼（h OCTN2经典底物）的细胞积聚研究,得到高活性的MDCK-h OCTN1和MDCK-h OCTN2单克隆细胞。（2）应用MDCK-h OCTN1和MDCK-h OCTN2细胞模型,考察WY-01对h OCTN1和h OCTN2的抑制作用,并进一步考察WY-01是否为h OCTN1或h OCTN2的底物。（3）应用稳定表达人有机阳离子转运体2（h OCT2）、人多药及毒素外排转运体1和2K（h MATE1、h MATE2-K）及瞬转人小肽转运体2（h PEPT2）的细胞模型,进行细胞积聚研究,考察WY-0... 

【文章来源】：浙江工业大学浙江省

【文章页数】：103 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
第一章 转运体OCTN1/2 和WY-01的研究进展
    1.1 药物转运体与OCTN1/2 概述
    1.2 OCTN1/2 分子特征与组织分布
    1.3 OCTN1/2 底物及功能特征
        1.3.1 OCTN1生理底物麦角硫因
        1.3.2 OCTN2生理底物左旋肉碱
        1.3.3 OCTN1/2 非生理底物
    1.4 OCTN1/2 临床相关疾病
    1.5 肾脏转运体与药物的相互作用
        1.5.1 转运体参与药物的肾脏处置
        1.5.2 肾脏转运体的分布与作用
    1.6 WY-01的研究进展
        1.6.1 WY-01的治疗作用和副作用
        1.6.2 WY-01的药代动力学
        1.6.3 WY-01与转运体的研究现状
    1.7 本课题研究内容
第二章 稳定表达hOCTN1/2 细胞模型的构建
    2.1 仪器与材料
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 试剂与药品
        2.1.3 实验试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 hOCTN1/2 基因制备
        2.2.2 pcDNA3.1（+）-hOCTN1/2质粒构建
        2.2.3 MDCK细胞的稳定转染
        2.2.4 MDCK-hOCTN1/2单克隆细胞株功能鉴定
        2.2.5 Real-Time PCR检测mRNA表达
        2.2.6 MDCK-hOCTN1/2 细胞积聚经典底物的功能研究
        2.2.7 数据分析
    2.3 结果
        2.3.1 h OCTN1/2 基因制备
        2.3.2 pc DNA3.1（+）-h OCTN1/2 质粒构建
        2.3.3 MDCK-h OCTN1/2 单克隆细胞功能鉴定
        2.3.4 Real-Time PCR检测m RNA表达
        2.3.5 MDCK-h OCTN1/2 细胞的积聚功能研究
    2.4 实验小结
    2.5 实验讨论
        2.5.1 重组质粒转染宿主细胞
        2.5.2 MDCK-hOCTN2单克隆株筛选的底物选择
        2.5.3 hOCTN1/2 转运特征
第三章 hOCTN1/2 与WY-01的相互作用研究
    3.1 实验仪器和材料
        3.1.1 主要仪器
        3.1.2 试剂与药品
        3.1.3 实验相关试剂配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 WY-01对MDCK-hOCTN1/2 细胞摄取底物的抑制作用
        3.2.2 WY-01的LC-MS/MS分析方法
        3.2.3 WY-01在MDCK-h OCTN1/2 细胞上的积聚
        3.2.4 样品处理
        3.2.5 WY-01在MDCK-hOCTN1/2 细胞上的积聚
        3.2.6 数据处理与分析
    3.3 结果
        3.3.1 细胞基质中WY-01 LC-MS/MS方法的建立与验证
        3.3.2 WY-01对hOCTN1/2 的抑制
        3.3.3 WY-01是hOCTN1/2 的底物
        3.3.4 时间和pH对WY-01积聚的影响
        3.3.5 WY-01在MDCK-h OCTN1/2 细胞上的积聚动力学
    3.4 实验小结
    3.5 实验讨论
第四章 WY-01与肾脏阳离子转运体的相互作用研究
    4.1 实验仪器与材料
        4.1.1 仪器
        4.1.2 试剂与药品
        4.1.3 常用试剂配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 MDCK-hOCT2细胞对WY-01的摄取
        4.2.2 MDCK-hMATE1/2-K细胞对WY-01的摄取
        4.2.3 WY-01在CHO-hPEPT2细胞中的积聚
        4.2.4 样品检测方法
        4.2.5 数据处理与分析
    4.3 结果
        4.3.1 细胞模型功能验证
        4.3.2 WY-01与hOCT2的相互作用
        4.3.3 WY-01与hMATE1、hMATE2-K的相互作用
        4.3.4 WY-01与hPEPT2的相互作用
    4.4 实验小结
    4.5 实验讨论
        4.5.1 肾脏转运体与WY-01的相互作用
        4.5.2 WY-01对生理物质体内转运的影响
创新性
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表论文情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]稳定表达hMATE1及共表达hMATE1与hOCT1或hOCT2细胞模型的构建[J]. 雷红梅,孙思源,李丽萍,涂美娟,周慧,曾苏,蒋惠娣.  药学学报. 2015(07)



本文编号：3117083