胰蛋白酶产生菌的筛

发布时间：2017-04-20 05:05

  本文关键词：胰蛋白酶产生菌的筛选、发酵优化及酶学性质，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胰蛋白酶是一种重要的蛋白酶,在医药、皮革加工、食品工业及农业领域具有重要应用价值。目前市售胰蛋白酶仍以动物源为主,受到制备成本高、动物性病毒风险以及宗教问题等因素制约,导致其应用存在限制。微生物源胰蛋白酶可以有效解决上述问题,且微生物发酵生产胰蛋白酶具有生产成本低、产量和酶活高、制备简便等特点。然而,目前多数研究仍主要围绕动物源胰蛋白酶展开,微生物胰蛋白酶的潜力还远未得到开发。本论文从某皮革厂采集样品,以脱脂奶粉为唯一碳氮源初筛产蛋白酶的菌株,再通过摇瓶发酵复筛,结合特异性酶活检测筛选获得8株具有较高胰蛋白酶活性的菌株,并择其中一株产酶达20 U·m L-1的菌株DMN6进行后续研究。通过生理生化与16S r DNA分子鉴定,将该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。通过单因素实验对菌株DMN6产酶条件进行优化,结果表明,该菌株产胰蛋白酶的最优条件为,玉米粉15 g·L-1,大豆蛋白胨15 g·L-1,磷酸氢二钾7 g·L-1,磷酸二氢钾3 g·L-1,三氯化铁5 mmol·L-1,氯化镁15 mmol·L-1,接种量为1%,37℃下培养84 h,优化后的发酵酶活可达140 U·m L-1,相比优化前提高了7倍。采用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Superdex 75凝胶层析对发酵液中胰蛋白酶进行分离纯化,纯化后胰蛋白酶回收率为24.5%,纯化倍数为8.5倍,比酶活可达350.0 U·mg-1。SDS-PAGE分析显示,其分子量为44 k Da。对纯化后的胰蛋白酶进行酶学性质表征,结果表明,该酶的最适反应温度为65℃,最适p H为9.0,并表现出良好的温度和p H适应范围。该酶在45℃下仍能保持85%以上的酶活,且具有良好的稳定性,表明该酶在较低温度的工业条件下具有较好前景。Ba2+在低浓度下对该胰蛋白酶活性有明显的促进作用,而其它多数金属离子则表现出一定抑制作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF可以强烈抑制该酶的活性,说明该酶为丝氨酸蛋白酶类。表面活性剂对酶具有一定抑制作用。以BAEE为底物测定其酶促反应动力学参数,结果显示Km和Vmax分别为0.75 mmol·L-1和184 U·m L-1。
【关键词】：胰蛋白酶 地衣芽孢杆菌 筛菌 发酵优化 酶学性质
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R945
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-15
• 1.1 蛋白酶概述8
• 1.1.1 蛋白酶8
• 1.1.2 蛋白酶的分类8
• 1.2 胰蛋白酶概述8-10
• 1.2.1 胰蛋白酶的发现与起源8-9
• 1.2.2 胰蛋白酶的空间结构9
• 1.2.3 胰蛋白酶的催化机制9-10
• 1.3 胰蛋白酶的应用10-11
• 1.3.1 医药领域应用10
• 1.3.2 皮革加工应用10-11
• 1.3.3 食品工业应用11
• 1.3.4 农业应用11
• 1.4 胰蛋白酶近期研究进展11-12
• 1.4.1 酶的分离纯化11-12
• 1.4.2 酶的基因工程研究12
• 1.4.3 酶的固定化12
• 1.5 微生物源胰蛋白酶12-13
• 1.5.1 真菌类12-13
• 1.5.2 细菌类13
• 1.6 研究意义与研究内容13-15
• 1.6.1 研究意义13-14
• 1.6.2 研究内容14-15
• 第二章 产胰蛋白酶菌株的筛选与鉴定15-28
• 2.1 实验材料15-17
• 2.1.1 筛菌样品来源15
• 2.1.2 培养基15-16
• 2.1.3 实验试剂16-17
• 2.1.4 主要仪器及设备17
• 2.2 实验方法17-22
• 2.2.1 产胰蛋白酶菌株的筛选17-18
• 2.2.2 产胰蛋白酶菌株的分子鉴定18-20
• 2.2.3 产胰蛋白酶菌株的形态及生理生化鉴定20-22
• 2.3 结果与讨论22-27
• 2.3.1 产胰蛋白酶菌株的筛选22-24
• 2.3.2 产胰蛋白酶菌株的 16S rDNA分子鉴定及同源性分析24-25
• 2.3.3 菌株DMN6菌株形态特征与生理生化鉴定25-27
• 2.4 本章小结27-28
• 第三章 地衣芽孢杆菌DMN6胰蛋白酶的发酵条件优化28-38
• 3.1 实验材料28-29
• 3.1.1 培养基28
• 3.1.2 菌株28
• 3.1.3 实验试剂28-29
• 3.1.4 主要仪器及设备29
• 3.2 实验方法29-31
• 3.2.1 菌体生长及产酶曲线29
• 3.2.2 发酵条件的优化29
• 3.2.3 发酵培养基成分的优化29-30
• 3.2.4 中试试验30-31
• 3.3 结果与讨论31-37
• 3.3.1 菌体生长及产酶曲线31
• 3.3.2 发酵条件对产酶的影响31-33
• 3.3.3 发酵培养基成分对产酶的影响33-36
• 3.3.4 中试试验结果36-37
• 3.4 本章小结37-38
• 第四章 胰蛋白酶的分离纯化及其酶学性质38-50
• 4.1 实验材料38-39
• 4.1.1 培养基38
• 4.1.2 菌株38
• 4.1.3 实验试剂38
• 4.1.4 主要仪器及设备38-39
• 4.2 实验方法39-41
• 4.2.1 胰蛋白酶的纯化39-40
• 4.2.2 BCA法测定蛋白质浓度40
• 4.2.3 变性蛋白凝胶电泳（SDS-PAGE）40
• 4.2.4 胰蛋白酶的酶学性质40-41
• 4.3 结果与讨论41-48
• 4.3.1 胰蛋白酶的纯化41-44
• 4.3.2 胰蛋白酶的酶学性质44-48
• 4.4 本章小结48-50
• 主要结论50
• 展望50-52
• 致谢52-53
• 参考文献53-57
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张燕;陈剑;刘海静;陆敏;;石蜡切片免疫荧光法在肾病穿刺组织中的应用[J];北京大学学报(医学版);2011年06期

2 周桂,谭学才,黄在银,李梅,黄逢蔼;胰蛋白酶对壳聚糖的降解研究[J];广西农业生物科学;2002年01期

3 宋东奎,钱书虹,吴波,常连胜,杨太森,苗延宗;胰蛋白酶加乙二胺四乙酸钠溶解草酸钙结石实验研究[J];郑州大学学报(医学版);2002年04期

4 冯志彪,李冬梅 ,张伟;螺旋藻蛋白质的胰蛋白酶促水解[J];食品与机械;2002年01期

5 纳嵘;钱利纯;孙建义;王永军;;胰蛋白酶水解甲鱼蛋白参数的优化[J];食品工业科技;2009年08期

6 张鹤;赵雨;徐云凤;李芸彤;赵大庆;;胰蛋白酶水解梅花鹿鹿筋胶原工艺条件的研究[J];食品科技;2010年09期

7 陈红丽;邵惠芳;于建军;杨永锋;;胰蛋白酶提取硫酸软骨素单因素优化研究[J];应用化工;2008年07期

8 冷春生;李庆伟;;牛胰蛋白酶制备工艺的改进及其对基因工程人胰岛素前体的酶切作用[J];沈阳药科大学学报;2013年01期

9 齐奇;刘河涛;杨文君;王银;余建强;;胰蛋白酶水解制备胰酪胨的工艺条件研究[J];中国乳品工业;2014年05期

10 黄康健;;胰蛋白酶治疗蛇咬伤336例报告[J];中级医刊;1979年05期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 孙立新;蚊抗药性相关基因NYD-Tr和NYD-Ch蛋白表达及其对溴氰菊酯代谢的研究[D];南京医科大学;2006年

2 令桢民;Streptomyces griseus胰蛋白酶的分子改造[D];江南大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 熊春蓉;胰蛋白酶降解溴氰菊酯的实验研究[D];南京医科大学;2009年

2 王琨;南极磷虾胰蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究[D];大连理工大学;2013年

  本文关键词：胰蛋白酶产生菌的筛选、发酵优化及酶学性质，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：317931