甲硝唑特异性适配体的筛选和应用
发布时间：2021-07-02 20:48
甲硝唑是一种硝基咪唑衍生物药物,凭借其出色的抗菌性能而闻名,对滴虫、阿米巴原虫和厌氧菌有效,然而过度使用甲硝唑会有致畸、致癌和引发神经中毒的风险。因此,有必要开发一种具有高灵敏度和高选择性的甲硝唑测定方法。适配体是具有独特性质的单链寡核苷酸序列,可以折叠成特定的3D结构特异性结合各种靶标。适配体是通过化学合成方法制造的,因此不会诱导免疫原性,并且可以进行化学修饰以提高稳定性或实现标记,这样可以实现可重复、廉价和快速的生产。适配体选自含有约1015个不同序列的寡核苷酸文库,通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选适配体。SELEX由重复的筛选和扩增组成,在每个循环中,保留、回收和扩增对靶标具有特定亲和力的寡核苷酸。在10-15个循环后,SELEX就可以得到一个由与既定的靶标结的寡核酸序列组成的富集文库,其中结合亲和力强并且特异性良好的最优序列最终可以称为适配体。适配体的截短是提高亲和力并降低检测成本的有效策略,原始适配体在应用时序列太长,因此需要进一步优化获得更高效的适配体。基于固定DNA文库的磁珠-SELEX技术,从全长为79nt的随机ssDNA文库中筛选...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
适配体通过构象互补识别并结合其靶标Fig.1-1Aptamersrecognizeandbindtheirtargetviaconformationalcomplementary
江南大学硕士学位论文4图1-2SELEX技术筛选示意图Fig.1-2SELEXtechnologyscreeningdiagram1.2.2SELEX技术的发展传统的SELEX几经进行了广泛的应用，筛选得到很多高效的“明星”适配体。近年来，开发了许多方法来更可靠和有效地产生适配体。本文主要分析一些适配体领域最新筛选方法和新兴SELEX技术。这些方法和技术主要通过指数富集方法SELEX进行的配体系统进化及其变化，例如免疫沉淀偶联SELEX（IP-SELEX），捕获SELEX（Capture-SELEX），细胞SELEX（Cell-SELEX），毛细管电泳SELEX（CE-SELEX），原子力显微镜SELEX（AFM-SELEX）和人工扩展的遗传信息系统SELEX（AEGIS-SELEX）。（1）免疫沉淀偶联SELEX（IP-SELEX）适配体的亲和力和特异性在很大程度上取决于其靶标的三维结构。由于人工重组蛋白的三维目标可能与其天然构象不同，因此在标准生理条件下体外筛选适配体往往可能并不是筛选到具有最高亲和力和特异性的适配体的最佳方法[27]。开发IP-SELEX就是为了解决这个问题。尽管IP-SELEX可与传统SELEX方法相提并论，但它包括免疫沉淀步骤，可将天然形式的所需靶标“拉扯”下来。这导致适配体的富集在正常生理条件下仍具有识别蛋白质的能力。在IP-SELEX的第一轮筛选中，将带有目标蛋白质的细胞与ssDNA文库在缓冲液和适合的条件下孵育。随后，裂解细胞，并使用抗体包被的磁珠免疫沉淀目标蛋白。几轮洗涤后，从珠上洗脱蛋白-适配体复合物，并PCR扩增DNA序列以进行下一轮筛眩重复筛选对靶标具有高特异性和亲和力的寡核苷酸的过程，从而使它们最终富集，最后通过测序确定筛选的适配体[28]。（2）捕获SELEX（Capture-SELEX）与大多数SELEX方法需要将靶标固定在固体表面上相比，Capture-SELEX用于可溶性小分子靶标。Capture-SELEX利用一个特殊的
80%，据报道，食用动物中使用的抗生素达到1.46万吨[69,70]。根据贝叶斯统计模型，流行病学家VanBoeckel小组[71]进行了保守的估计，全球食用动物中的抗生素消费量到2030年将达到惊人的20万吨。人类和兽用抗生素的广泛使用导致抗生素不断释放到环境中，目前在地表水和废水中检测到多种抗生素残留物。由于当前市政饮用水和废水处理基础设施缺乏抗生素去除功能，因此饮用水源中很有可能已经污染并残留抗生素。鉴于此，我们需要确定食用动物和饮用水源中过度使用抗生素造成的威害，并且实现快速、准确、灵敏检测抗生素。图1-3甲硝唑分子的分子结构与3D结构图Fig.1-3Molecularstructureand3Dstructureofmetronidazolemolecule甲硝唑属于硝基咪唑类抗生素，是人工合成的具有5-硝基咪唑基本结构的抗菌抗原虫药物。甲硝唑为白色至浅黄色结晶性粉末，有轻微气味苦咸味，pH（饱和水溶液）约为6.5，熔点为158-160℃，结构如图1-3所示。甲硝唑用于预防和治疗厌氧菌引起的感染，如呼吸道、消化道、腹腔及盆腔感染，皮肤软组织、骨和骨关节等部位的感染等，此外还广泛应用于预防和治疗口腔厌氧菌。甲硝唑作为禽类、畜类以及水产养殖
【参考文献】：
期刊论文
[1]硝基咪唑类药物检测技术研究进展[J]. 尚彬如,张丽英. 中国畜牧杂志. 2010(01)
本文编号：3261201
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
适配体通过构象互补识别并结合其靶标Fig.1-1Aptamersrecognizeandbindtheirtargetviaconformationalcomplementary
江南大学硕士学位论文4图1-2SELEX技术筛选示意图Fig.1-2SELEXtechnologyscreeningdiagram1.2.2SELEX技术的发展传统的SELEX几经进行了广泛的应用，筛选得到很多高效的“明星”适配体。近年来，开发了许多方法来更可靠和有效地产生适配体。本文主要分析一些适配体领域最新筛选方法和新兴SELEX技术。这些方法和技术主要通过指数富集方法SELEX进行的配体系统进化及其变化，例如免疫沉淀偶联SELEX（IP-SELEX），捕获SELEX（Capture-SELEX），细胞SELEX（Cell-SELEX），毛细管电泳SELEX（CE-SELEX），原子力显微镜SELEX（AFM-SELEX）和人工扩展的遗传信息系统SELEX（AEGIS-SELEX）。（1）免疫沉淀偶联SELEX（IP-SELEX）适配体的亲和力和特异性在很大程度上取决于其靶标的三维结构。由于人工重组蛋白的三维目标可能与其天然构象不同，因此在标准生理条件下体外筛选适配体往往可能并不是筛选到具有最高亲和力和特异性的适配体的最佳方法[27]。开发IP-SELEX就是为了解决这个问题。尽管IP-SELEX可与传统SELEX方法相提并论，但它包括免疫沉淀步骤，可将天然形式的所需靶标“拉扯”下来。这导致适配体的富集在正常生理条件下仍具有识别蛋白质的能力。在IP-SELEX的第一轮筛选中，将带有目标蛋白质的细胞与ssDNA文库在缓冲液和适合的条件下孵育。随后，裂解细胞，并使用抗体包被的磁珠免疫沉淀目标蛋白。几轮洗涤后，从珠上洗脱蛋白-适配体复合物，并PCR扩增DNA序列以进行下一轮筛眩重复筛选对靶标具有高特异性和亲和力的寡核苷酸的过程，从而使它们最终富集，最后通过测序确定筛选的适配体[28]。（2）捕获SELEX（Capture-SELEX）与大多数SELEX方法需要将靶标固定在固体表面上相比，Capture-SELEX用于可溶性小分子靶标。Capture-SELEX利用一个特殊的
80%，据报道，食用动物中使用的抗生素达到1.46万吨[69,70]。根据贝叶斯统计模型，流行病学家VanBoeckel小组[71]进行了保守的估计，全球食用动物中的抗生素消费量到2030年将达到惊人的20万吨。人类和兽用抗生素的广泛使用导致抗生素不断释放到环境中，目前在地表水和废水中检测到多种抗生素残留物。由于当前市政饮用水和废水处理基础设施缺乏抗生素去除功能，因此饮用水源中很有可能已经污染并残留抗生素。鉴于此，我们需要确定食用动物和饮用水源中过度使用抗生素造成的威害，并且实现快速、准确、灵敏检测抗生素。图1-3甲硝唑分子的分子结构与3D结构图Fig.1-3Molecularstructureand3Dstructureofmetronidazolemolecule甲硝唑属于硝基咪唑类抗生素，是人工合成的具有5-硝基咪唑基本结构的抗菌抗原虫药物。甲硝唑为白色至浅黄色结晶性粉末，有轻微气味苦咸味，pH（饱和水溶液）约为6.5，熔点为158-160℃，结构如图1-3所示。甲硝唑用于预防和治疗厌氧菌引起的感染，如呼吸道、消化道、腹腔及盆腔感染，皮肤软组织、骨和骨关节等部位的感染等，此外还广泛应用于预防和治疗口腔厌氧菌。甲硝唑作为禽类、畜类以及水产养殖
【参考文献】：
期刊论文
[1]硝基咪唑类药物检测技术研究进展[J]. 尚彬如,张丽英. 中国畜牧杂志. 2010(01)
本文编号：3261201
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