Subfatin脂肪特异性过表达小鼠模型的构建及胰岛素敏感性研究

发布时间：2017-04-27 02:04

  本文关键词：Subfatin脂肪特异性过表达小鼠模型的构建及胰岛素敏感性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人们很早就知道脂肪组织是人体最大的储能器官,随着上个世纪九十年代Leptin(瘦素)的发现,人们逐渐意识到脂肪组织也是一个高度活跃的内分泌器官,它能分泌各种生物活性肽或蛋白质,统称为脂肪因子,参与调节机体许多重要的病理生理过程。由于肥胖已成为全球性健康问题,是许多重要疾病的主要危险因子,而体内脂肪组织过多又是肥胖患者的重要特点之一,因此,了解脂肪因子与肥胖的关系,探索脂肪因子的具体生理功能,对治疗肥胖产生的病理学后果是非常有价值的。目前,人们对于脂肪因子的研究已取得许多重要进展,比如有学者提出用Leptin或Leptin联合低剂量胰岛素治疗糖尿病,有助于维持血糖稳态；我们前期大量研究证明Visfatin可以作为治疗脑卒中的新靶点,等等。在过去二十年间,不断有新的脂肪因子被发现,目前科学界大概报道了超过100种脂肪因子。本室于2008年首次利用限食模型找到了一个新的脂肪因子,取名为Subfatin。本室前期的初步试验结果表明：Subfatin在白色脂肪组织表达较高,其在限食大鼠的白色脂肪组织中表达下调,而在高脂饮食诱导的肥胖小鼠白色脂肪组织中表达上调,在脂肪细胞分化过程中表达逐渐升高。据此我们认为,Subfatin可能参与脂肪功能的调节,并影响肥胖及机体代谢。制备脂肪细胞特异性过表达的转基因动物模型,是研究脂肪因子整体功能的可靠手段之一。为了研究脂肪细胞来源的Subfatin对脂肪组织生物学及代谢功能的影响,本课题构建了Subfatin脂肪特异性过表达小鼠模型,并对该小鼠模型的胰岛素敏感性进行了探索。实验方法1.pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin质粒的构建(1)利用pIRES-EGFP-Subfatin质粒PCR扩增获得Subfatin cDNA -his6,并将其插入pBS aP2 promoter (5.4 kb) poly A质粒,构建了 pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin质粒,即Subfatin脂肪组织特异性过表达载体。(2)对pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin质粒进行基因测序。2.转基因小鼠的制备(1)将线性化的载体片段(含aP2 promoter、Subfatin cDNA-his6、Poly A)显微注射进C57BL/6小鼠的受精卵中。(2)将受精卵移植入C57BL/6假孕母鼠的输卵管壶腹部,监护假孕母鼠生产,鉴定F0代转基因小鼠的基因型。(3)选出阳性首建鼠,与C57BL/6小鼠回交,获得F1代转基因小鼠,鉴定基因型。3.转基因小鼠的表达验证(1)应用半定量RT-PCR, Real-time PCR的方法检测Subfatin基因的转录情况。(2)应用免疫组化的方法检测脂肪组织Subfatin蛋白的表达情况。(3)用ELISA测定血清中Subfatin蛋白的浓度。4.转基因小鼠的胰岛素敏感性研究(1)在正常饮食和高脂饮食条件下对转基因小鼠的体重、食量进行称重。(2)在正常饮食和高脂饮食条件下对转基因小鼠进行葡萄糖耐量实验(GTT)。(3)在高脂饮食条件下对转基因小鼠进行胰岛素耐量实验(ITT)。(4)在高脂饮食条件下对转基因小鼠进行高胰岛素性正糖(HIEG)钳夹实验。结果1.基因测序结果表明,pBluescript Ⅱ SK (+)-aP2-Subfatin质粒上aP2 Promoter-Subfatin区域的核苷酸序列分别与小鼠aP2 Promoter基因核苷酸序列及Subfatin mRNA编码序列一致。说明Subfatin脂肪组织特异性过表达载体构建成功。2.对假孕母鼠产下的F0代转基因小鼠进行基因型鉴定,得到四只阳性首建鼠。3.半定量RT-PCR结果表明,在所取的脑组织、肾组织、心脏组织、肌肉组织、棕色脂肪组织和白色脂肪组织中,外源性Subfatin (Subfatin-his6)只有在棕色脂肪组织和白色脂肪组织中是过表达的。4. Real-time PCR结果表明,Subfatin在阳性转基因小鼠脂肪组织中的转录水平大大高于野生型小鼠,说明转基因小鼠脂肪组织中Subfatin是过表达的。5.免疫组化的结果表明,Subfatin蛋白在阳性转基因小鼠白色脂肪组织中的表达明显高于野生型小鼠,同样说明转基因小鼠脂肪组织中Subfatin是过表达的。6. ELISA的结果表明,Subfatin蛋白在阳性转基因小鼠血清中的浓度的确高于野生型小鼠,该结果与Subfatin蛋白的分泌性质相符合,同时也验证了其在转基因小鼠体内是过表达的。7.在正常饮食或高脂饮食饲养条件下,转基因小鼠和野生型小鼠的体重、食量均无显著性差异。8.GTT实验结果表明,在正常饮食饲养条件下,转基因小鼠和野生型小鼠的胰岛素敏感性无显著差异；而在高脂饮食饲养条件下,转基因小鼠的胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠。9.ITT实验、HIEG钳夹实验结果均表明,在高脂饮食饲养条件下,转基因小鼠的胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠。综上所述,本课题成功构建了Subfatin脂肪特异性过表达小鼠模型,并发现高脂饮食饲养条件下,转基因小鼠的胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠,说明脂肪组织Subfatin能对抗高脂诱导的胰岛素抵抗。
【关键词】：Subfatin 脂肪因子 脂肪特异性过表达 转基因小鼠 胰岛素敏感性
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-13
• 前言13-17
• 第一部分 构建表达载体pBluescriptⅡSK(+)-aP2-Subfatin17-37
• 一、引言17-19
• 二、实验材料与方法19-30
• (一) 目的基因片段的扩增与回收19-22
• (二) 目的基因插入表达载体22-25
• (三) 转化及质粒抽提25-27
• (四) 鉴定阳性菌落27-30
• 三、结果与讨论30-37
• (一) 目的基因的扩增与回收30-31
• (二) 阳性菌落鉴定结果31-32
• (三) 阳性克隆测序32-37
• 第二部分 Subfatin脂肪特异性过表达转基因小鼠的鉴定及培育37-60
• 一、引言37-39
• 二、实验材料与方法39-55
• (一) 阳性首建鼠的基因鉴定39-41
• (二) 转基因小鼠的mRNA表达检测41-46
• (三) 转基因小鼠脂肪组织表达Subfatin蛋白的检测46-50
• (四) 转基因小鼠血清中Subfatin蛋白的浓度测定50-53
• (五) 转基因小鼠扩大繁殖53-55
• 三、结果与讨论55-60
• (一) 阳性首建鼠的确立55-56
• (二) 各组织的RT-PCR结果56
• (三) Real-time PCR结果56-57
• (四) 转基因小鼠脂肪组织Subfatin蛋白的检测57-58
• (五) 转基因小鼠血清中Subfatin蛋白浓度的测定58
• (六) 转基因小鼠的扩大繁殖58-60
• 第三部分 转基因小鼠的胰岛素敏感性研究60-76
• 一、引言60
• 二、实验材料与方法60-70
• (一) 体重、食量测定60-61
• (二) 葡萄糖耐量实验61-63
• (三) 血清中胰岛素浓度测定63-64
• (四) 胰岛素耐量实验64-66
• (五) 高胰岛素性正糖钳夹实验66-70
• 三、结果与讨论70-76
• (一) 体重、食量70-72
• (二) 葡萄糖耐量实验72-74
• (三) 胰岛素耐量实验74-75
• (四) 高胰岛素性正糖钳夹实验75-76
• 全文总结76-77
• 参考文献77-82
• 综述82-92
• 参考文献89-92
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明92-93
• 附录93-104
• 致谢104

【共引文献】

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本文编号：329670