基于代谢组学的白念珠菌对唑类药物交叉耐药机制的研究

发布时间：2017-04-29 14:13

  本文关键词：基于代谢组学的白念珠菌对唑类药物交叉耐药机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白念珠菌引起的侵袭性真菌感染率和死亡率与日俱增,给临床抗真菌感染治疗带来很大困扰。唑类药物,尤其是氟康唑,因其安全性高、疗效好和副作用小而成为防治真菌感染的一线药物,但其仅具有抑菌作用,因此在长期治疗过程中产生了耐药性,使其对氟康唑耐药的同时对其他结构不同、作用靶点不同的抗真菌药物也产生耐药性。近年来,耐药菌的出现使真菌防治治疗雪上加霜。因此,研究白念珠菌对唑类药物的交叉耐药机制显得迫切重要。代谢组学旨在从整体角度表征机体的代谢调控网络,其研究特点与白念珠菌复杂的耐药机制不谋而合。在本课题组前期研究基础上,我将进行代谢足迹分析和磷脂代谢组学分析,从而完善白念珠菌代谢组学研究平台,为了验证该平台的有效性,我们将其用于白念珠菌对唑类药物交叉耐药机制及紫草素抗被膜型白念珠菌作用机制研究：针对磷脂的结构特点及其特征碎片离子,构建亲水作用色谱串联三重四级杆质谱联用系统(HILIC-QQQ/MS)。在对色谱质谱条件和提取方法优化的基础上,将该方法成功应用于白念珠菌磷脂代谢组学研究。结果表明,磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺是含量较多的两类磷脂,C16:0、C16:1、C17:1、C18:0、C18:1、C18:2和C18：3是白念珠菌中的主要脂肪酸。给药组中PE(32：2)含量显著降低,而脂肪酸不饱和指数显著升高,表明两性霉素B可能通过影响细胞膜流动性和破坏细胞膜的稳定性而发挥抗真菌作用,从另一角度证明两性霉素B的作用靶点位于细胞膜。该方法的建立为后续的白念珠菌对唑类药物的交叉耐药机制研究奠定基础。采用UPLC-Q-TOF/MS和GC-MS高通量分析技术相结合的代谢组学方法对白念珠菌细胞内和细胞外代谢物分别进行代谢指纹分析和代谢足迹分析,从多层次、多角度、最大限度的获取样品中的有效信息的基础上,进一步细化差异代谢物产生的原因,通过多元统计学方法分析得到25个菌株不同生物标志物、43个敏感菌药物应激相关标志物、45个耐药菌药物应激相关标志物和20个菌株耐药强弱相关标志物,把菌株是否耐药做为因素A,把给药与否做为因素B,采用双因素方差分析发现其中25个相关标志物是交互作用产生的。这些标志物主要涉及氨基酸代谢、三羧酸循环、应激代谢、磷脂代谢和鞘脂代谢。进一步采用HILIC-QQQ/MS对白念珠菌耐药相关通路进行代谢靶标分析,挖掘与耐药密切相关的磷脂。这些发现揭示了耐药菌可能通过增强对外界刺激的抵抗力、降低细胞内活性氧、增强药物外转运蛋白的过表达、改变细胞膜流动性、破坏细胞膜稳定性以及影响线粒体功能来降低对抗真菌药物的敏感性,从而达到抗真菌药物作用。我们以被膜型白念珠菌为研究对象,建立气相色谱-质谱联用(GC-MS)的代谢组学方法来研究中药活性单体紫草素抗被膜型白念珠菌的代谢调控机制,通过多元统计学分析筛选到19个紫草素给药相关的生物标志物,主要涉及氨基酸代谢、三羧酸循环、糖酵解、能量代谢、脂肪酸代谢和应激反应,这一结果表明紫草素可能是通过调控这些代谢通路发挥对被膜型白念珠菌的抗真菌作用。本论文首次采用UPLC-Q-TOF/MS、GC-MS和HILIC-QQQ/MS多种分析技术相结合的方法从多层次、多角度、最大限度获取样品信息的基础上,对白念珠菌进行代谢组学研究,从而更全面、更精确的阐明白念珠菌对唑类药物交叉耐药机制和紫草素抗被膜型白念珠菌代谢调控机制,为新型抗真菌药物的研发提供新的思路。
【关键词】：代谢组学 白念珠菌 唑类药物 交叉耐药 紫草素 磷脂代谢组学
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-17
• 第一章 基于HILIC-QQQ/MS建立白念珠菌磷脂代谢组学分析方法17-27
• 一、实验部分18-21
• (一) 试剂18
• (二) 菌株和培养基18
• (三) 仪器18-19
• (四) LC-QQQ/MS条件19
• (五) 混合内标溶液的配制19
• (六) 样品制备19-20
• (七) 数据处理20-21
• 二、实验结果21-25
• (一) 6种甘油磷脂的色谱图21
• (二) 提取回收率21-22
• (三) HILIC-QQQ/MS色谱图22-23
• (四) 样品测定23-25
• 三、讨论25-26
• 四、本章小结26-27
• 第二章 基于代谢组学的白念珠菌对唑类药物交叉耐药机制的研究27-57
• 一、实验部分27-33
• (一) 试剂27
• (二) 菌株和培养基27-28
• (三) 仪器28-29
• (四) 样品制备29-30
• (五) GC-MS分析30-31
• (六) UPLC-Q-TOF/MS分析31-32
• (七) HILIC-QQQ/MS分析32
• (八) 数据处理32-33
• 二、实验结果33-48
• (一) 氟康唑耐药菌的产生33
• (二) GC-MS、UPLC-Q-TOF/MS和HILIC-QQQ/MS代谢轮廓33-36
• (三) 细胞内潜在生物标志物的筛选和鉴别36-40
• (四) 细胞外潜在生物标志物的筛选和鉴别40-47
• (五) 磷脂代谢组学数据分析47-48
• 三、讨论48-55
• (一) 菌株不同相关标志物49-51
• (二) 敏感菌药物应激相关标志物51-52
• (三) 耐药菌药物应激相关标志物52-53
• (四) 菌株耐药强弱相关标志物53-54
• (五) 交互作用产生的相关标志物54-55
• (六) 磷脂代谢组学研究55
• 四、本章小结55-57
• 第三章 基于GC-MS技术的紫草素作用白念珠菌生物被膜的代谢组学研究57-67
• 一、实验部分57-60
• (一) 试剂57
• (二) 菌株和培养基57-58
• (三) 仪器58
• (四) 样品制备58-59
• (五) 样品前处理59
• (六) 数据处理59-60
• 二、结果60-64
• (一) GC-MS代谢轮廓60-61
• (二) 数据分析61-64
• 三、讨论64-65
• 四、本章小结65-67
• 总结67-69
• 参考文献69-80
• 综述：脂质组学在微生物领域中的研究进展80-89
• 参考文献86-89
• 在读期间发表文章和参加科研工作情况89-90
• 致谢90

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