基于秀丽线虫模型的抗热休克活性菌株高通量筛选研究

发布时间：2022-02-15 00:54

　　秀丽线虫（秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans）是第一个全基因组测序的多细胞生物,其60-80%的基因为人类同源基因,拥有约40%的人类疾病相关基因。热休克反应与许多疾病相关,如在神经退行性疾病中发挥保护作用。本文以以秀丽线虫为模型、以海参c DNA文库为基础、以抗热激能力为主要指标,在整体动物水平上建立从cDNA表达文库筛选活性菌株的高通量筛选方法方法。主要结果如下:（1）高通量筛选平台及筛选条件优化。首先以96孔板和384孔板为基础,探索了溶液体积、细菌浓度、检测时间等筛选条件,同时检验了秀丽线虫对不同菌株的食物偏好性,然后针对相应条件摸索了荧光拍照和图片分析条件,最终确定了整个筛选流程。在此过程中,将自动移液工作站、微型模式生物自动分选系统和高内涵自动成像设备进行串联,有效用于高通量筛选。其中,移液工作站可实现批量精确加液,微型模式生物自动分选系统主要工作为精确分选秀丽线虫至微孔板,高内涵成像系统主要检测微孔板内秀丽线虫的荧光强度并对数据进行分析。这些设备的应用和整合减少了重复性劳动和人为失误,增加了实验的可靠性,提高了筛选效率。（2）抗热激菌株高通量筛选方法... 

【文章来源】：广东药科大学广东省

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

用于高通量筛选的秀丽线虫表型

广东药科大学硕士研究生学位论文13本研究使用高内涵成像系统的明场和FITC通道对经过热激胁迫的秀丽线虫进行拍照并使用该系统内的数据处理软件分析数据。此外，我们也使用该设备的DAPI通道检测秀丽线虫脂褐素含量。图1.2高通量仪器示意图1.4研究意义热休克反应是一种在神经退行性疾病中发挥保护作用的反应，是调节神经系统疾病的主要靶标之一[104]。该反应通过产生多种热休克蛋白保护机体免受高温、氧化应激、重金属等胁迫的伤害。传统的药物筛选方法筛选范围窄、准确度低、指标单一，而在整体动物水平上筛选则需要大量人力物力。尽管由于小鼠与人类之间的遗传联系紧密，人们也对使用小鼠进行药物测试非常感兴趣，但此类研究费力、昂贵且对难以生成大量数据。秀丽线虫被证明是在药物发现过程初期的药物和药物测试应用的高度有利的生物学模型。尽管秀丽线虫对人类的基因组匹配性比实验室小鼠低，但许多疾病基因是人类和秀丽线虫所共有的，而秀丽线虫具有生命周期短、体积小和雌雄同体的优势，而且培养容易、价格低，可以用液体培养。本论文结合高通量仪器，采用以秀丽线虫为模型的高通量筛选系统，以热激为胁迫条件，大规模筛选海参cDNA文库，构建了筛选表达抗热激蛋白的活性菌株的高通量筛选方法。1.5研究思路高通量筛选可以以特定的指标快速、高效的筛选化合物库，寻找具有成药潜力的化合物。根据实验室前期构建的海参cDNA文库，结合实验室现有的移液工作站、COPASBiosort和高内涵成像设备三台高通量筛选的仪器，以抗热激能力为指标，使用秀丽线虫整体动物模型，我们实现了对cDNA文库的筛眩在过程中，利用自动移液工作站解决秀丽线虫培养液、药物、染料的大批量添加问题，利用COPASBiosort解决秀丽线虫分选和状态、数量的差异问题，利

广东药科大学硕士研究生学位论文14像设备解决大批量拍照和分析问题。首先将含有海参cDNA片段的质粒导入到大肠杆菌中，加入诱导剂使该片段表达出蛋白。将已表达目的蛋白的大肠杆菌喂食秀丽线虫一段时间后，加入荧光染料，进行热激处理。最后使用高内涵成像设备进行成像并分析荧光面积。SYTOXgreen荧光染料只能将死亡的秀丽线虫染色，因此，荧光面积的大小与秀丽线虫的死亡时间相关，秀丽线虫死亡时间越晚，荧光面积便越小，表明秀丽线虫可能食用含有表达蛋白的大肠杆菌后对热激的抵抗能力增强。表达这种抗热激蛋白的菌株正是我们需要筛选出的活性菌株。以下为实验思路图：图1.1高通量筛选技术流程图


本文编号：3625586