三条谷胱甘肽生物合成途径在酿酒酵母中组合表达的研究

发布时间：2017-05-13 14:14

  本文关键词：三条谷胱甘肽生物合成途径在酿酒酵母中组合表达的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是一种广泛存在于生物体内的生物活性三肽化合物。半胱氨酸残基上的巯基使其在生物体内发挥重要的生理功能,如抗氧化、解毒和免疫调控等。GSH已经被广泛应用于医药、食品和化妆品等行业。在大多数生物体内,GSH主要由y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh1)和谷胱甘肽合成酶(Gsh2)两个酶依次催化合成；在一些致病性革兰氏阳性细菌中,存在一种双功能的合成酶(GshF)可单独催化GSH的合成；此外,在Gsh1缺陷的细胞中发现了一条GSH合成的替代途径,通过参与脯氨酸生物合成的第一个功能蛋白酶γ-谷氨酰激酶(GK)的功能来实现对Gsh1的替代作用。随着对GSH生物合成和代谢过程的深入研究,利用基因工程手段构建GSH高产菌株,然后进行工业发酵是GSH生产的最有效手段,关于Gshl/Gsh2或GshF在宿主细胞中单独高表达的研究有很多。本研究希望提供一个新的技术方法,即将目前发现的三条GSH合成途径在宿主细胞中进行组合表达,进一步增强工程菌GSH的合成能力,为工业化生产提供新的技术方案。主要研究结果如下：一、γ-谷氨酰激酶参与的GSH合成途径的确证和GSH的合成通过敲除酿酒酵母内源的gshl基因,同时替换为酿酒酵母和大肠杆菌的γ-谷氨酰激酶编码基因,然后比较获得的重组菌株对过氧化氢的耐受性,发现高表达酿酒酵母自身的γ-谷氨酰激酶(Pro1)可增强Gshl缺陷的菌株对过氧化氢的耐受性；在酿酒酵母W303-1b中高表达γ-谷氨酰激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白(Pro1-GshB),获得的重组菌株W303-1b/P的GSH合成能力得到一定程度的提升。结果表明高表达Pro1可以通过积累Y-谷氨酰磷酸进而合成GSH。二、三条GSH生物合成途径的组合表达和GSH的合成在酿酒酵母W303-1b中高表达谷胱甘肽合成酶-连接肽-γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶融合蛋白(Gsh2-Gsh1),获得重组菌株W303-1b/G,与工程菌W303-1 b/P和实验室前期构建重组菌株W303-1b/F(高表达双功能酶GshF)一起代表高表达单途径工程菌,对三条GSH合成途径进行组合表达,获得重组双途径组合工程菌W303-1b/FG、W303-1b/FP和三途径组合工程菌W303-1b/FGP。摇瓶发酵结果表明W303-1b/F在单途径工程菌中GSH产量最高,为187 mg/L,单位OD值的产量为2.45 mg/L/OD,组合新的途径可进一步提高GSH产量,三途径组合菌株W303-lb/FGP的产量最高,为217 mg/L,单位OD值GSH产量为2.78 mg/L/OD;前体氨基酸添加实验结果进一步证实了三个途径组合的优势,表现出更强的前体氨基酸转化能力,通过添加前体,W303-lb/FGP的GSH产量提高61.37%,而单途径菌株W303-1b/F的GSH产量仅提高43.17%。三、10L发酵罐放大培养对三途径工程菌W303-1b/FGP进行了10L发酵罐放大培养,为菌株的高密度发酵做初步探索。结果表明,工程菌在放大培养中稳定性较好,通过利用发酵罐控制发酵参数,与摇瓶相比发酵周期明显缩短,发酵24 h后GSH产量达273 mg/L,单位OD值的产量为2.7 mg/L/OD,通过补糖可进一步实现生物量与产量的提升。综上所述,三途径组合方法进一步提高了工程菌GSH的合成能力,三途径工程菌打破了单途径工程菌产量的瓶颈,其在GSH工业生产上具有很大潜力,为进一步工业化生产菌株的优化提供技术借鉴。
【关键词】：谷胱甘肽 三途径组合 酿酒酵母
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 符号缩写说明5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-14
• 1.1 谷胱甘肽的基本介绍10
• 1.2 GSH的生理功能及应用10-11
• 1.3 GSH的生物合成11-12
• 1.4 GSH的生产方式12-13
• 1.5 本课题主要研究内容和目的13-14
• 第二章 实验材料与常用实验方法14-23
• 2.1 实验材料14-17
• 2.2 常用实验方法17-23
• 第三章 γ-谷氨酰激酶参与GSH合成的功能鉴定和GSH的合成研究23-39
• 3.1 引言23
• 3.2 实验材料23
• 3.3 实验方法23-33
• 3.4 实验结果33-37
• 3.4.1 替代途径相关基因克隆33
• 3.4.2 替代途径同源整合表达载体的构建与鉴定33
• 3.4.3 gsh1基因敲除载体的构建与鉴定33
• 3.4.4 重组gsh1基因敲除菌株转化与鉴定33-35
• 3.4.5 重组替代途径高表达菌株转化与鉴定35-36
• 3.4.6 重组gsh1基因敲除菌株对H_2O_2的耐受36-37
• 3.4.7 重组替代途径高表达菌株摇瓶发酵合成GSH37
• 3.5 小结与讨论37-39
• 第四章 三条GSH生物合成途径组合研究39-55
• 4.1 引言39
• 4.2 实验材料39-41
• 4.3 实验方法41-47
• 4.4 实验结果47-54
• 4.4.1 酿酒酵母gsh2和gsh1的基因克隆47-48
• 4.4.2 标准途径同源整合表达载体的构建与鉴定48
• 4.4.3 重组标准途径高表达菌株转化与鉴定48-49
• 4.4.4 重组标准途径高表达菌株摇瓶发酵合成GSH及三条GSH合成途径比较49
• 4.4.5 双功能酶途径基因剂量对GSH产量的影响49-50
• 4.4.6 重组三途径组合高表达菌株转化与鉴定50-51
• 4.4.7 重组三途径组合高表达菌株摇瓶发酵合成GSH51-52
• 4.4.8 氨基酸前体添加对工程菌GSH产量和生物量的影响52-54
• 4.5 小结与讨论54-55
• 第五章 10L发酵罐放大培养55-60
• 5.1 引言55
• 5.2 实验材料55-56
• 5.3 实验方法56-57
• 5.4 实验结果57-59
• 5.4.1 批次发酵57
• 5.4.2 补料分批发酵57-59
• 5.5 小结与讨论59-60
• 第六章 结论与展望60-62
• 6.1 论文总结60-61
• 6.2 展望61-62
• 本论文的创新点62-63
• 参考文献63-67
• 文献综述：谷胱甘肽胞外发酵研究进展67-77
• 参考文献73-77
• 附录77-84
• 个人简历、硕士期间论文和专利84-85
• 致谢85-86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王玮玮;唐亮;周文龙;杨燕;高波;赵云峰;王伟;;谷胱甘肽生物合成及代谢相关酶的研究进展[J];中国生物工程杂志;2014年07期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 杨建花;新型双功能谷胱甘肽合成酶的克隆表达、酶学性质及应用研究[D];华东理工大学;2012年

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本文编号：362774