NLRC5的甲基化修饰对巨噬细胞表型变化的调控作用和部分机制研究

发布时间：2017-05-14 12:11

  本文关键词：NLRC5的甲基化修饰对巨噬细胞表型变化的调控作用和部分机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：巨噬细胞是先天免疫反应中必不可少的组成成分,它来源于外周血中的单核细胞,当单核细胞从循环系统中迁移和通过内皮细胞外渗,进一步分化成各种组织驻留的巨噬细胞。类似于Th1/Th2细胞分化,巨噬细胞在不同的微环境下也可以分化为两种成熟的表型,通常被称作M1型和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞也称之为经典活化的巨噬细胞,可由干扰素γ(IFN-γ)或与脂多糖(LPS)共同刺激产生,而M2型(即选择性活化的巨噬细胞)可由各种细胞因子诱导,包括IL-4、IL-13和免疫复合物等。一般来说,M1型活化的巨噬细胞高表达IL-12和IL-23,低表达IL-10;代谢精氨酸,产生高水平的诱导型一氧化氮合酶(i NOS),此外M1型巨噬细胞分泌大量的促炎因子如IL-1β,IL-6和TNF-α等。相反,M2型活化的巨噬细胞高表达IL-10,低表达IL-12和Il-23,并产生精氨酸酶。更重要的是,这两种表型的巨噬细胞具有复杂的异质性和功能的多样性,其中许多特征相互矛盾:包括促炎症活性和抗炎活性,促肿瘤活性和抗肿瘤活性,免疫原性和免疫耐受性,还有组织破坏性和组织修复性。上述的这些表型和功能变化的巨噬细胞对于很多疾病都具有重要作用,例如肝纤维化、肿瘤、肥胖症等。靶向巨噬细胞表型变化并针对这些疾病的微环境来相应地改变巨噬细胞的表型可能成为治疗疾病的新的希望。但是目前巨噬细胞的表型变化以及潜在的机制尚未明确。NOD样受体家族,是最近被发现的免疫系统中的一个模式识别受体,已经被证明可以调控炎症反应和Ⅰ类MHC转录。本实验室的前期研究发现NOD样受体家族的成员之一,NLRC5(由氨基酸的CARD样区域、中间的NOD样区和羧基端的亮氨酸重复序列区域三部分组成)对巨噬细胞炎症因子分泌有着负性调控的作用,也证实了NLRC5对肝纤维化的作用及可能机制(NF-κB信号通路)。根据NLRC5能够有效抑制机体的天然免疫和炎症反应,进一步探索NLRC5是否对巨噬细胞表型变化起到调控作用并探讨潜在的机制,本研究主要分为以下几个部分:1.建立RAW264.7细胞的M1和M2两种表型变化模型。选用RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞株)为研究对象,使用LPS(1000 ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)共同作用12 h诱导巨噬细胞向M1型转化,而使用IL-4(15ng/ml)刺激细胞向M2型变化。2.NLRC5在两种表型变化巨噬细胞中的表达。实验研究的对象是RAW264.7细胞,分别用RTq-PCR和Western Blot法检测NLRC5在两种表型变化的巨噬细胞中m RNA和蛋白的表达。实验结果可以看出,M1表型的巨噬细胞中NLRC5的表达降低,而M2中NLRC5的表达升高,重复试验结果经过统计分析,与正常组相比,差异具有统计学意义。3.NLRC5的下游调控机制研究。实验研究的对象是RAW264.7细胞。有文献报道Notch信号通路在M1型巨噬细胞表型变化中起到重要的作用,本文通过脂质体LipofectamineTM2000转染NLRC5 RNAi和p EGFP-C2-NLRC5后使用倒置荧光显微镜观察转染效率,Western Blot法检测NLRC5沉默和过表达后Notch1以及下游蛋白Hes1的表达,结果提示NLRC5调控M1型巨噬细胞转化可能是由Notch信号通路介导的。4.NLRC5的上游调控机制研究。以RAW264.7细胞为研究对象,RT-q PCR和Western Blot结果显示在M1型表型变化的巨噬细胞给予甲基化抑制剂(5-azad C)可以明显增加NLRC5的表达,并同时也可以减少M1型标志物(i NOS、TNF-α)的表达,且差异具有统计学意义;然后我们利用焦磷酸测序的方法检测NLRC5启动子区域的甲基化状态,进一步证明了NLRC5在M1型巨噬细胞中甲基化的发生;再次,我们通过小干扰RNA对甲基化转移酶抑制剂1(DNMT1)进行沉默,结果发现M1巨噬细胞中NLRC5的表达降低可能是NLRC5的高甲基化引起的。
【关键词】：巨噬细胞表型变化 NLRC5 DNMT1 Notch信号 RAW264.7
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 英文缩咯词6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 1. 前言14-15
• 2. 实验材料与实验方法15-33
• 2.1 实验材料15-17
• 2.1.1 实验细胞15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.1.3 仪器与设备16-17
• 2.1.4 图像分析软件17
• 2.2 实验方法17-33
• 2.2.1 RAW264.7细胞培养17
• 2.2.2 RAW264.7细胞表型变化模型的建立与鉴定17-18
• 2.2.3 实验检测内容与方法18-33
• 3. 结果33-50
• 3.1 RAW264.7细胞M1和M2表型变化模型的建立与鉴定33-37
• 3.1.1 RAW264.7细胞表型变化模型的建立33-35
• 3.1.2 RAW264.7细胞表型变化模型的鉴定35-37
• 3.2 NLRC5对RAW264.7细胞M1和M2的调控作用37-43
• 3.2.1 RAW264.7细胞M1和M2模型中NLRC5mRNA和蛋白表达的变化37-38
• 3.2.2 过表达NLRC5抑制RAW264.7细胞M1表型变化38-41
• 3.2.3 沉默NLRC5促进RAW264.7细胞M1表型变化41-43
• 3.3 NLRC5通过Notch1信号调控M1表型变化43-45
• 3.3.1 Notch1在巨噬细胞表型变化过程中的表达43-44
• 3.3.2 沉默和过表达NLRC5对Notch信号通路和M1表型变化标志物蛋白表达的影响44-45
• 3.4 NLRC5的上游调控机制45-50
• 3.4.1 NLRC5在RAW264.7细胞M1和M2中的甲基化状态45-46
• 3.4.2 DNA甲基化抑制剂5-azadC对RAW264.7细胞的影响46-48
• 3.4.3 DNMT1调控RAW264.7细胞1表型变化48-50
• 4. 讨论50-53
• 5. 结论53-54
• 参考文献54-58
• 附录58-60
• 致谢60-61
• 综述61-80
• References74-80

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