新型苯并噁唑酮衍生物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎活性及其作用机制的研究

发布时间：2022-07-08 12:56

　　研究背景:本课题组前期以苯并噁唑酮为母环,设计合成了一系列4位取代衍生物,经过活性初步筛选发现,4-邻甲基苯磺酰氧基-苯并噁唑酮（MBB）、3-（2-苯基）乙基-4-（2-苯基）氧基苯并噁唑-2-酮（W6I）、4-5’-二甲氨基萘-1’-磺酰氧基-苯并噁唑酮（W3D）具有较好的抗炎活性,但此类化合物作用机制及靶点尚不明确。目的:本论文旨在通过建立LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型进一步评价此类化合物的抗炎活性,并初步探讨优选化合物的抗炎作用机制和靶点。方法:第一部分4-取代苯并噁唑酮类衍生物抗炎活性研究1.MTT法测定4-取代苯并噁唑酮类衍生物对RAW264.7细胞活力的影响。2.Griess法测定4-取代苯并噁唑酮类衍生物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响。ELISA法测定4-取代苯并噁唑酮类衍生物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2的影响。3.二甲苯致小鼠耳肿胀法研究4-取代苯并噁唑酮类衍生物体内抗炎活性。第二部分化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88-NF-κB... 

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前言
第一部分 4-取代苯并噁唑酮类衍生物抗炎活性研究
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞、动物及化合物来源
            1.1.2 主要仪器和试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 细胞培养
            1.2.2 MTT法检测化合物对RAW264.7细胞活力的影响
            1.2.3 Griess法测定化合物对RAW264.7细胞培养上清中NO的释放的影响
            1.2.4 ELISA法测定化合物对RAW264.7细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、iNOS释放量的影响
            1.2.5 二甲苯致小鼠耳肿胀法研究4-取代苯并噁唑酮类衍生物的体内抗炎活性
            1.2.6 统计分析
    2 结果
        2.1 化合物MBB、W6I、W3D对RAW264.7细胞活力的影响
        2.2 化合物MBB、W6I、W3D对RAW264.7细胞培养上清液中NO的释放的影响
        2.3 化合物MBB、W6I、W3D对RAW264.7细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1 β、iNOS、COX-2释放量的影响
        2.4 化合物MBB、W6I、W3D对二甲苯所致的小鼠耳肿胀的影响
    3 讨论
    4 结论
第二部分 化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的调控作用
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞与化合物来源
            1.1.2 主要仪器与试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 Westernblot法检测化合物W3D对TLR4、MyD88、p-IRAK4、NF-κB、p-P38、p-ERK、IL-6、iNOS蛋白表达的影响
            1.2.2 荧光实时定量PCR法检测化合物W3D对TLR4、MyD88、NF-κBmRNA表达的影响
            1.2.3 统计分析
    2 结果
        2.1 化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、MyD88、p-IRAK4蛋白表达的影响
        2.2 Westernblot法测定化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞p-P38和p-ERK蛋白表达的影响
        2.3 化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞胞浆胞核NF-κB蛋白表达的影响
        2.4 化合物W3D对炎症效应蛋白IL-6、iNOS表达的影响
        2.5 化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、MyD88、NF-κBmRNA表达的影响
    3 讨论
    4 结论
第三部分 化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎活性靶点的初探
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞与化合物来源
            1.1.2 主要仪器与试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 Westernblot法检测4-取代苯并噁唑酮类化合物对TLR4、p-NF-κB蛋白表达影响
            1.2.2 流式细胞术检测化合物W3D对FITC-LPS结合细胞膜表面受体的竞争性抑制作用
            1.2.3 Griess法检测TLR4阻断剂TAK242对化合物W3D的NO抑制活性的影响
            1.2.4 Elisa法检测TLR4阻断剂TAK242对化合物W3D的抑制TNF-α、IL-6、IL-1β活性的影响
            1.2.5 Westernbolt法测定TLR4阻断剂TAK242作用后化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞中TLR4、p-IRAK4、p-NF-κB蛋白表达的影响
            1.2.6 统计分析
    2 结果
        2.1 Westernblot法测定4-取代苯并噁唑酮类衍生物对TLR4、p-NF-κB蛋白表达影响
        2.2 流式细胞术检测化合物W3D对FITC-LPS结合细胞膜表面受体的竞争性抑制作用
        2.3 TLR4抑制剂TAK242对化合物W3D的NO抑制活性的影响
        2.4 TLR4阻断剂TAK242对化合物W3D抑制TNF-α、IL-6、IL-1β活性的影响
        2.5 TLR4阻断剂TAK242对化合物W3D抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中TLR4、p-IRAK4、p-NF-κB蛋白表达的影响
    3 讨论
    4 结论
第四部分 化合物W3D作用于LPS诱导的RAW264.7细胞的RNA-seq测序研究
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞及化合物来源
            1.1.2 仪器和试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 总RNA的提取与质控
            1.2.2 RNA文库的构建及质量检测
            1.2.3 上机测序
            1.2.4 测序质量评估及基因定量
            1.2.5 样品差异基因的筛选
            1.2.6 样品差异基因GO富集分析
            1.2.7 样品差异基因KEGGPathway富集分析
            1.2.8 实时荧光定量PCR验证差异基因
    2 结果
        2.1 数据比对和质控
        2.2 mRNA表达量分析(FPKM)
        2.3 RNA-seq差异表达分析
        2.4 差异基因GO功能分析
        2.5 差异基因KEGGpathway分析
        2.6 差异基因的验证
    3 讨论
    4 结论
全文结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
在学期间承担/参与的科研课题与研究成果
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
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[3]炎症因素与早期类风湿关节炎心血管病变相关性研究[J]. 于水莲,陶怡,王羿升,黄闰月,刘明岭,黄成辉,黄文辉.  中华风湿病学杂志. 2016 (11)
[4]二甲苯致小鼠耳肿胀急性炎症模型的建立[J]. 谷捷,李鑫,余黄合,王宝新,黄惠勇,曾嵘,蔡雄.  湖南中医药大学学报. 2016(05)
[5]Toll样受体4配体的研究进展[J]. 朱雪坤,杨日芳,孟艳秋.  中国药理学与毒理学杂志. 2016(04)
[6]小鼠耳肿胀模型及药理应用[J]. 周娟,张梦军,郭嘉伟,李滨,张惠静.  国际检验医学杂志. 2012(17)
[7]氯喹对脂多糖/内毒素诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88非依赖信号转导途径的抑制作用[J]. 王艳艳,刘鑫,曹红卫,王宁,鲁永玲,郑江.  第三军医大学学报. 2010(09)
[8]天然产物4-O-β-D-葡萄糖-苯并噁唑酮及4-取代苯并噁唑酮衍生物的合成与活性研究[J]. 唐莉,班树荣,林文翰,李青山.  中国药物化学杂志. 2009(01)
[9]诱导型一氧化氮合酶抑制剂研发现状[J]. 洁西卡,桃李,章李军,李亚娟,Fetid Murad,卞卡.  现代生物医学进展. 2007(11)
[10]氯唑沙宗的合成工艺改进[J]. 张晓艳.  精细化工原料及中间体. 2006(06)



本文编号：3657069