氨肽酶N抑制剂毛细管电泳在线筛选方法的研究

发布时间：2023-01-31 06:24

　　氨肽酶N（Aminopeptidase N, APN）是属于锌离子依赖性金属蛋白酶的一类膜结合型外肽酶,以同源二聚体结构存在于细胞膜。APN广泛存在于大脑、肾、肝脏、胎盘和子宫等。与正常细胞相比,APN在癌细胞表面高水平表达,对肿瘤细胞的侵袭、转移和肿瘤新血管的形成起着重要的作用,被称为肿瘤细胞表面相关抗原CD13。近年来,以APN为靶点的肿瘤治疗策略迅速发展起来,APN抑制剂已经成为抗癌药物研究的热点课题。因此,发展和建立快速、可靠及高通量APN抑制剂筛选方法对于研发新药物具有十分重要的现实意义。毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）具有样品消耗量少、分离效率高、分析时间短及自动化程度高等优点,被广泛应用于酶反应的测定中,成为了酶活性及酶抑制剂筛选研究常使用的分析手段。电泳调控微分析法（Electrophoretically Mediated Microanalysis, EMMA）是以毛细管电泳柱进样端约1.5～2.0 cm部分作为反应的微室,将酶溶液和底物溶液依次进样到毛细管中,接着施加一段时间小电压让酶和底物溶液在毛细管中充分混合并反应,当酶促... 

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
符号说明
前言
    1 氨肽酶N与肿瘤的关系
        1.1 降解细胞外基质,促进原发肿瘤的生长侵袭转移
        1.2 促进肿瘤细胞新血管生成
    2 氨肽酶N抑制剂
        2.1 APN的天然抑制剂
        2.2 APN的小分子合成类抑制剂
    3 氨肽酶N及其抑制剂的活性测定方法
    4 毛细管电泳法在酶反应动力学研究中的应用
        4.1 毛细管电泳在酶反应测定中的应用模式
        4.2 电泳调控微分析法在酶反应测定中的应用
    5 毛细管电泳法在药物与细胞膜作用研究中的应用
        5.1 细胞膜与药物的相互作用
        5.2 细胞膜毛细管电泳法
    6 本课题研究目的及主要内容
第一章 氨肽酶N抑制剂电泳调控微分析筛选方法的研究和应用
    1 仪器与材料
        1.1 仪器
        1.2 材料
        1.3 电泳条件
    2 实验方法
        2.1 溶液的配制
        2.2 毛细管柱的维护
        2.3 EMMA步骤
        2.4 氨肽酶N活性研究
        2.5 氨肽酶N抑制剂抑制动力学研究及抑制剂的筛选
        2.6 酶标法
    3 结果与讨论
        3.1 检测波长的选择
        3.2 分离条件的优化与选择
            3.2.1 电泳分离模式的选择
            3.2.2 分离缓冲液中脱氧胆酸钠浓度的考察
            3.2.3 分离缓冲溶液HEPES浓度的考察
            3.2.4 分离缓冲溶液pH影响
            3.2.5 电泳温度的考察
            3.2.6 分离电压的考察
        3.3 EMMA条件的优化
            3.3.1 混合条件的选择
            3.3.2 酶促反应时间的考察
            3.3.3 底物浓度的考察
        3.4 方法验证
        3.5 氨肽酶N的K_m和V_(max)的测定
            3.5.1 酶标法测定氨肽酶N的K_m和V_(max)
            3.5.2 EMMA法测定氨肽酶N的K_m和V_(max)
        3.6 阳性抑制剂APN抑制动力学分析
        3.7 抑制剂筛选
            3.7.1 初筛
            3.7.2 复筛
            3.7.3 筛选结果分析
    4 小结
第二章 氨肽酶N细胞膜毛细管电泳法的建立与药物筛选
    1 仪器与材料
        1.1 仪器
        1.2 材料
        1.3 电泳条件
    2 实验方法
        2.1 溶液的配制
        2.2 细胞培养
        2.3 细胞膜的制备
            2.3.1 细胞膜的分离提取
            2.3.2 细胞膜破碎方法的考察
            2.3.3 细胞膜表征
        2.4 细胞膜CE法
        2.5 模型的验证
        2.6 细胞膜APN动力学参数测定
        2.7 精密度考察
        2.8 抑制剂的筛选
    3 结果与讨论
        3.1 细胞膜制备
            3.1.1 细胞膜分离提取
            3.1.2 细胞膜的表征
        3.2 筛选模型的验证
        3.3 测定细胞膜表面氨肽酶N的K_m
        3.4 精密度考察
        3.5 抑制剂筛选
            3.5.1 初筛
            3.5.2 复筛
    4 小结
全文总结
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
学位论文评阅及答辩情况表


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3733778