CRISPR/Cas9介导的基因定点整合CHO细胞高效表达系统

发布时间：2023-04-12 04:01

　　背景和目的:中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是工业生产重组蛋白类生物药物最主要的细胞株,2016年全球销量排名前十的生物药物中,有7个都是利用CHO系统表达生产的。这主要得益于以下几个方面:CHO细胞具有与人体相似的复杂的翻译后修饰功能,可以进行糖基化等翻译后修饰,从而产生具有良好生物活性的重组蛋白;作为鼠源的CHO细胞可以避免人类细胞特异性病毒的污染;CHO细胞已实现无血清驯化培养和悬浮式高密度生长,能够很好地满足工业生产需求。目前工业构建重组蛋白工程细胞株的一般方法,是将携带有目的基因的载体转染进入宿主细胞,通过多轮的加压筛选及鉴定,最终筛选得到随机整合目的基因并能够高效表达的细胞株。该方法耗时较长,一般需要6¹2个月,筛选工作量和难度均较大,此外,由于“位置效应”的影响,随着培养时间的延长,一些高产细胞株会出现产量下降的不稳定现象。通过筛选高效稳定的整合位点,将定点整合技术应用于工业细胞株的建立是解决以上问题的理想途径。CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术,是通过CRISPR/Cas9核酸酶使基因组在特定位点发生双链断裂,当携带有同源臂及外源基因的供体载体...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词
第一章 绪论
    1.1 抗体药物及生产现状
        1.1.1 抗体药物简介
        1.1.2 抗体药物的生产现状
    1.2 基因定点整合技术的研究进展
        1.2.1 基因定点整合技术简介
        1.2.2 基因定点整合技术的研究现状
    1.3 CRISPR/Cas9 技术在基因定点整合中的应用
        1.3.1 CRISPR/Cas9 技术简介
        1.3.2 CRISPR/Cas9 介导的基因定点整合技术的研究现状
第二章 CHO-S细胞mCherry基因及anti-PD1 基因定点整合细胞株的筛选和鉴定
    2.1 引言
    2.2 材料和试剂
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 主要仪器和设备
        2.2.3 主要试剂
    2.3 实验方法和结果
        2.3.1 sgRNA的设计及编辑效率的检测
        2.3.2 供体质粒的构建
        2.3.3 细胞培养和转染
        2.3.4 细胞筛选和鉴定
        2.3.5 单克隆细胞的筛选和鉴定
    2.4 实验结果
        2.4.1 sgRNA的设计及编辑效率的检测
        2.4.2 供体质粒的构建
        2.4.3 细胞筛选和鉴定
        2.4.4 单克隆细胞的筛选和鉴定
    2.5 讨论
第三章 CHO-S细胞基因定点整合细胞株的性质评价
    3.1 引言
    3.2 材料和试剂
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 主要仪器和设备
        3.2.3 主要试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 生长性质的比较
        3.3.2 转录水平的检测
        3.3.3 脱靶效率的检测
    3.4 实验结果
        3.4.1 野生型细胞株和定点整合细胞株的生长性质比较
        3.4.2 野生型细胞株、定点整合细胞株和随机整合细胞株的基因转录水平比较
        3.4.3 定点整合细胞株的脱靶效率评价
    3.5 讨论
第四章 CHO-S稳定整合细胞株表达蛋白的稳定性及质量评价
    4.1 引言
    4.2 材料和试剂
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 主要仪器和设备
        4.2.3 主要试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 蛋白表达量的检测和稳定性的评价
        4.3.2 anti-PD1 蛋白的亲和力分析
        4.3.3 anti-PD1 蛋白的糖基化分析
    4.4 实验结果
        4.4.1 蛋白表达量的检测和稳定性的评价
        4.4.2 anti-PD1 蛋白的亲和力分析
        4.4.3 anti-PD1 蛋白的糖基化分析
    4.5 讨论
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间的成果



本文编号：3790387