亚麻刺盘孢静息细胞转化去氢表雄酮工艺及产物分离提取

发布时间：2017-05-23 06:28

  本文关键词：亚麻刺盘孢静息细胞转化去氢表雄酮工艺及产物分离提取，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：三羟基雄甾烯酮(7α,15α-di OH-DHEA)是合成屈螺酮的重要中间体,而屈螺酮是口服避孕药“优思明”的主要有效成分。采用生物转化法可直接催化去氢表雄酮(DHEA)得到7α,15α-di OH-DHEA。但在传统的转化工艺中,底物的投料浓度和转化效率均较低,从而影响了其工业过程的经济性。本论文以实验室经复合诱变得到的一株能够转化DHEA的菌株Colletotrichum lini ST-1为研究对象,通过优化工艺条件,建立了静息细胞转化工艺,并对产物的分离提取过程进行了优化。主要研究工作如下:(1)C.lini ST-1静息细胞转化DHEA工艺的建立。通过摇瓶转化条件的优化,确定了最适转化条件:细胞浓度12 g·L-1,转化p H 6.5,磷酸钠缓冲液浓度0.2 M,装液量30 m L·250 m L-1,转速220 r min-1,温度30℃。在此条件下,当底物投料浓度为10 g·L-1时,产物7α,15α-di OH-DHEA的摩尔得率为38.5%,较生长细胞转化工艺提高了21.0%。(2)静息细胞转化过程中,底物粉碎及助溶工艺的研究。为了进一步提高底物转化效率,尝试了底物粉碎和溶剂助溶两种方法。结果表明将底物粉碎后进行投料,同时添加2%的Tween 80,产物的摩尔得率提高到了72.0%。此外,验证了Tween 80的作用机制,结果表明添加Tween 80不仅能够促进底物的分散,而且还能增加细胞膜的通透性。在上述优化条件下尝试采用静息细胞进行批次转化。经过两批次的转化,在底物累计投料浓度18 g·L-1时,转化78 h后,7α,15α-di OH-DHEA的摩尔得率为60.5%。(3)在以上工作基础上,对转化液中终产物的分离提取工艺进行了优化,确定了最适的分离提取路线。首先对转化液的预处理过程和萃取过程进行了优化,粗提物收率达到了95%。然后优化了柱层析分离过程,并成功分离得到了目的产物7α,15α-di OH-DHEA。将分离得到的产物用乙酸乙酯进行结晶,产物纯度达到98%,纯化的总收率为91.3%。分别采用高效液相色谱、质谱、红外光谱及核磁共振分析鉴定了纯化产物的结构,确定纯化后的产物为7α,15α-di OH-DHEA。
【关键词】：Colletotrichum lini ST-1 去氢表雄酮 三羟基雄甾烯酮 静息细胞 生物转化 分离提取
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-16
• 1.1 甾体化合物概述8-9
• 1.1.1 甾体化合物的结构与分类8
• 1.1.2 甾体药物的现状8-9
• 1.2 甾体化合物的生物转化9-13
• 1.2.1 甾体化合物生物转化的发展历程9-10
• 1.2.2 甾体化合物生物转化的反应类型10
• 1.2.3 甾体化合物的羟基化反应10-11
• 1.2.4 甾体化合物羟基化反应的机理11
• 1.2.5 甾体化合物羟基化反应的限制因素11-13
• 1.3 去氢表雄酮的羟基化研究13-14
• 1.3.1 去氢表雄酮及其羟基化产物13
• 1.3.2 生物法合成 7α,15α-diOH-DHEA的研究进展13-14
• 1.3.3 静息细胞生物转化工艺14
• 1.4 本课题的研究意义14-15
• 1.5 本课题研究的主要内容15-16
• 第二章 静息细胞转化工艺的优化16-25
• 2.1 实验材料与仪器16-17
• 2.1.1 实验菌株16
• 2.1.2 培养基16-17
• 2.1.3 主要试剂17
• 2.1.4 主要仪器与设备17
• 2.2 实验方法17-19
• 2.2.1 菌体的培养17-18
• 2.2.2 生长细胞转化18
• 2.2.3 静息细胞的制备与转化18
• 2.2.4 静息细胞浓度的测定18
• 2.2.5 生长曲线的测定18
• 2.2.6 薄层层析（TLC）18
• 2.2.7 高效液相分析（HPLC）18-19
• 2.3 实验结果与讨论19-23
• 2.3.1 亚麻刺盘孢生长曲线19
• 2.3.2 静息细胞转化工艺的优化19-22
• 2.3.3 C. lini ST-1 静息细胞转化曲线22-23
• 2.3.4 静息细胞与生长细胞转化过程中各参数比较23
• 2.4 本章小结23-25
• 第三章 底物助溶对C. linli ST-1 静息细胞转化的影响25-34
• 3.1 实验材料与仪器25
• 3.2 实验方法25-27
• 3.2.1 菌体的培养25
• 3.2.2 静息细胞的制备与转化25
• 3.2.3 底物助溶的方法25-26
• 3.2.4 底物溶解性的测定26
• 3.2.5 静息细胞批次转化26
• 3.2.6 菌丝体形态的观察26
• 3.2.7 细胞膜脂肪酸含量的测定26
• 3.2.8 胞外蛋白浓度的测定26-27
• 3.2.9 薄层层析（TLC）27
• 3.2.10 高效液相分析（HPLC）27
• 3.3 实验结果与讨论27-33
• 3.3.1 底物的粉碎27
• 3.3.2 底物的助溶27-29
• 3.3.3 Tween 80 助溶效果评价29
• 3.3.4 Tween 80 作用机制验证29-32
• 3.3.5 静息细胞的批次转化32-33
• 3.4 本章小结33-34
• 第四章 产物的分离提取34-45
• 4.1 实验材料与仪器34-35
• 4.1.1 实验菌株34
• 4.1.2 培养基34-35
• 4.1.3 主要试剂35
• 4.1.4 主要仪器与设备35
• 4.2 实验方法35-37
• 4.2.1 转化液的收集35
• 4.2.2 转化液的预处理35-36
• 4.2.3 产物粗提36
• 4.2.4 产物分离36-37
• 4.2.5 薄层层析（TLC）37
• 4.2.6 高效液相分析（HPLC）37
• 4.2.7 产物的鉴定37
• 4.3 实验结果与讨论37-43
• 4.3.1 产物的粗提37-39
• 4.3.2 柱层析条件的选择39-42
• 4.3.3 产物的结晶42
• 4.3.4 分离提纯产物的鉴定42-43
• 4.4 本章小结43-45
• 主要结论与展望45-47
• 主要结论45
• 展望45-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-52
• 附录 1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文52-53
• 附录 2：7α,15α-diOH-DHEA结构鉴定图谱53-54

【参考文献】

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本文编号：387076