利用噬菌体展示淘选特异性结合sHB-EGF的活性多肽

发布时间：2017-06-06 10:09

  本文关键词：利用噬菌体展示淘选特异性结合sHB-EGF的活性多肽，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝素结合表皮生长因子(Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)能结合肝素,是表皮生长因子家族中的一员,与表皮生长因子受体结合后,以旁分泌、自分泌、近分泌的形式发挥其生物活性。HB-EGF在很多生理和病理过程中发挥着重要作用,例如伤口愈合、胚胎植入、动脉粥样硬化和心脏发育等。临床实验证明HB-EGF在乳腺癌和卵巢癌中过量表达,特异性抑制HB-EGF及其下游信号通路后,肿瘤细胞的凋亡数增加,生长速度变慢,血管生成受到抑制,迁移侵润速率变慢;且拮抗HB-EGF和抗癌药物联合用药时,肿瘤的抗药性大大降低,说明HB-EGF与乳腺癌和卵巢癌等肿瘤的发生、转移和抗药性有密切的关系。所以,开发特异性抑制HB-EGF的药物可能会抑制相应癌症的发生发展。通过在噬菌体外壳蛋白基因中插入序列随机的外源多肽编码序列,多肽以融合蛋白的形式被展示在病毒的表面,这样就使得病毒内编码外源多肽的基因序列与病毒表面的多肽建立了直接联系。体外噬菌体展示的流程是先将肽库与固定的靶分子结合,洗去未结合的噬菌体,继而将特异性结合的噬菌体洗脱下来并通过转染宿主菌进行扩增。三到五轮淘选之后,即可富集到与靶分子具有高亲和力的噬菌体。多肽的DNA序列可以通过测序得知。多肽药物具有免疫原性低、分子量小和易吸收等优点,所以本课题旨在通过噬菌体展示技术淘选到能特异性结合HB-EGF并能抑制其活性的多肽,从而为研发抗肿瘤药物奠定基础。本课题首先利用PCR获得sHB-EGF基因,经双酶切将目的基因导入原核表达载体pET-30a后,重组载体被转化进入宿主菌BL21(DE3),细菌经IPTG诱导大量表达出sHB-EGF。经镍柱亲和层析和肝素亲和层析纯化后我们得到大量纯蛋白(His)6-sHB-EGF。为避免后续实验中可能出现假阳性结果,我们用肠激酶去掉占全长重组蛋白53%的(His)6标签,得到sHB-EGF蛋白。我们以sHB-EGF为靶分子,按照结合-清洗-洗脱的流程进行了两次体外噬菌体展示:分别用肝素钠和sHB-EGF配制洗脱液进行淘选,并最终获得了三个候选多肽——TUZG1、2和3。后经ELISA实验证明:TUZG1、2和3都与sHB-EGF特异性结合。细胞划痕实验和Transwell实验证实,sHB-EGF具有促进卵巢癌细胞SKOV-3迁移和侵润的作用。通过多肽生物学效应验证实验,我们发现:候选多肽TUZG3能显著抑制sHB-EGF的促迁移和促侵润作用,而TUZG1和TUZG2对sHB-EGF的促迁移和促侵润作用没有显著影响。由于TUZG1和TUZG2是肝素钠洗脱下来的多肽,我们因此推测其可能具有与肝素类似的抗凝血作用。经APTT、试管法、剪尾法验证TUZG2确实具有与肝素类似的抗凝血活性。综上所述,我们通过分子克隆、原核表达、亲和层析等方法,获得了高纯度靶分子sHB-EGF;利用噬菌体展示获得了特异性结合sHB-EGF的三条候选多肽;最后经生物学效应验证发现,TUZG3能抑制sHB-EGF的促进癌细胞迁移和侵润的作用,为后续药物研发打下了基础。
【关键词】：HB-EGF 噬菌体展示 多肽 迁移侵润 抗凝血
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R96
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 绪论13-25
• 1.1 HB-EGF简介13-20
• 1.1.1 HB-EGF的基因结构13-14
• 1.1.2 HB-EGF的加工和信号通路14
• 1.1.3 HB-EGF与乳腺癌14-16
• 1.1.4 HB-EGF与卵巢癌16-18
• 1.1.5 HB-EGF在其他肿瘤中的作用18-19
• 1.1.6 利用HB-EGF抗癌的探索19-20
• 1.2 噬菌体展示技术在生物制药上的应用20-24
• 1.2.1 筛选特异性结合配体或蛋白的生物活性肽21
• 1.2.2 蛋白-蛋白互作21-22
• 1.2.3 筛选细胞特异性结合多肽22-23
• 1.2.4 淘选器官特异性结合多肽23-24
• 1.3 本课题的研究内容和意义24-25
• 第二章 sHB-EGF的原核表达25-39
• 2.1 实验仪器、材料与试剂25-27
• 2.1.1 仪器25-26
• 2.1.2 材料与试剂26-27
• 2.2 实验方法27-35
• 2.2.1 试剂配制27-30
• 2.2.2 目的基因sHB-EGF的获取30-31
• 2.2.3 表达载体pET-30a-His-HB-EGF的构建31-33
• 2.2.4 验证sHB-EGF插入载体33
• 2.2.5 诱导目的蛋白(His)6-sHB-EGF的表达33-34
• 2.2.6 验证(His)6-sHB-EGF的表达34-35
• 2.3 结果与分析35-37
• 2.3.1 pET-30a-His-sHB-EGF表达载体的构建35-36
• 2.3.2 验证(His)6-sHB-EGF的表达36-37
• 2.4 讨论与小结37-39
• 第三章 sHB-EGF的纯化39-44
• 3.1 实验仪器、材料与试剂39
• 3.1.1 仪器39
• 3.1.2 材料与试剂39
• 3.2 实验方法39-41
• 3.2.1 缓冲液的配制39-40
• 3.2.2 镍柱亲和层析40
• 3.2.3 肝素亲和层析40-41
• 3.2.4 肠激酶切去重组蛋白(His)6标签41
• 3.3 实验结果41-42
• 3.3.1 蛋白纯化和酶切去(His)6标签41-42
• 3.4 讨论与小结42-44
• 第四章 sHB-EGF对卵巢癌细胞SKOV3的作用44-56
• 4.1 实验仪器、材料与试剂44-46
• 4.1.1 仪器44
• 4.1.2 材料与试剂44-46
• 4.2 实验方法46-51
• 4.2.1 试剂配制46
• 4.2.2 MTT检测sHB-EGF对细胞增殖率的影响46-47
• 4.2.3 sHB-EGF过表达对癌细胞迁移侵润的影响47-49
• 4.2.4 sHB-EGF敲减对癌细胞迁移侵润的影响49-51
• 4.3 实验结果51-55
• 4.3.1 sHB-EGF对癌细胞增殖的影响51
• 4.3.2 sHB-EGF对癌细胞迁移和侵润的影响51-55
• 4.4 讨论与小结55-56
• 第五章 噬菌体展示预实验56-65
• 5.1 实验仪器、材料与试剂56-57
• 5.1.1 仪器56
• 5.1.2 材料与试剂56-57
• 5.2 实验方法57-63
• 5.2.1 试剂配制57-60
• 5.2.2 噬菌体滴度测定60
• 5.2.3 淘选流程60-62
• 5.2.4 单克隆噬菌体扩增62
• 5.2.5 测序62-63
• 5.3 实验结果63-64
• 5.3.1 随机序列分析63-64
• 5.4 讨论与小结64-65
• 第六章 淘选特异性结合sHB-EGF的多肽65-70
• 6.1 实验仪器、材料与试剂65
• 6.1.1 仪器65
• 6.1.2 材料与试剂65
• 6.2 实验方法65-67
• 6.2.1 试剂配制65
• 6.2.2 噬菌体滴度测定65-66
• 6.2.3 淘选流程66
• 6.2.4 单克隆噬菌体扩增66
• 6.2.5 测序66
• 6.2.6 ELISA检测多肽与靶分子的亲和力66-67
• 6.3 结果与分析67-69
• 6.3.1 随机多肽序列分析67-68
• 6.3.2 候选多肽TUZG1、TUZG2和TUZG3与靶分子的亲和力验证68-69
• 6.4 讨论与小结69-70
• 第七章 候选多肽的生物学效应验证70-76
• 7.1 实验仪器、材料与试剂70
• 7.1.1 仪器70
• 7.1.2 材料与试剂70
• 7.2 实验方法70-72
• 7.2.1 试剂配制70
• 7.2.2 随机肽Random 12的非特异性验证70
• 7.2.3 候选多肽TUZG1和TUZG2对癌细胞迁移和侵润的影响70-71
• 7.2.4 候选多肽TUZG3的抑癌效应验证71
• 7.2.5 TUZG1和TUZG2抗凝血作用检测71-72
• 7.3 结果与分析72-75
• 7.3.1 TUZG1和TUZG2对癌细胞迁移和侵润的影响72
• 7.3.2 多肽TUZG3对癌细胞迁移和侵润的影响72-73
• 7.3.3 TUZG1和TUZG2抗凝血作用检测73-75
• 7.4 讨论与小结75-76
• 第八章 总结与展望76-78
• 8.1 工作总结76
• 8.2 工作展望76-78
• 参考文献78-87
• 致谢87-88
• 在学期间发表的学术论文及其他科研成果88

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本文编号：426042