甲基苯丙胺急性作用的分子机制研究

发布时间：2017-06-07 05:20

  本文关键词：甲基苯丙胺急性作用的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)为化学合成物质,归属于苯胺类药物,纯白晶体状,熟称冰毒,常作为人工合成的兴奋剂使用,主要作用于中枢神经系统,能使人产生兴奋,欣快感并具有致幻性,因此,多次吸食可导致药物成瘾。长期使用甲基苯丙胺会引起多巴胺信号发生改变,导致机体内神经元产生异常和神经退行性的病变。急性注射METH后,脑区内多巴胺信号发生改变,但具体的多巴胺信号转导机制还太不清楚,因此,本文主要研究METH急性作用,可以进一步明确METH的作用机制。METH长期作用可引起细胞的信号分子如多巴胺(dopamine, DA)、多巴胺受体(dopamine receptor, DR)、多巴胺转运体(Dopamine transporter, DAT)细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5, CDK5)、及环磷酸腺苷调节的磷酸化蛋白-32(dopamine and cAMP-regulate phosphoprotein of mass-32, DARPP-32)等相关分子的改变。许多神经递质与大脑内复杂功能有关,多巴胺(dopamine, DA)是其中之一,DA作用范围广,在个体行为上和情感认知功能方面,以及奖赏效应中起重要的作用。DA主要通过与多巴胺受体(dopamine receptor, DR)结合,而发挥了各种功能。DR在各脑区的分布含量不一致,根据受体亚基差异,分为D1类受体和D2类受体。多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT)是一类典型的膜蛋白,主要分布在DA神经元结构的突触前膜,能对释放到突触间隙的DA进行再摄取,调节突触间隙的DA浓度,进而调控多巴胺能神经系统功能。硫氧还蛋白-1(Thioredoxin-1, Trx-1)是机体内广泛存在氧化还原调节蛋白,具有调节转录因子活性,抑制细胞凋亡的作用。中脑腹侧被盖区域(Ventral Tegmentale Area, VTA),伏隔核(nucleus accumbens, NAc)和额叶皮质是大脑中重要的脑区,与奖赏行为密切相关。本文采用嗜铬瘤细胞(rat pheochromaocytoma tumor cell line, PC 12 cells)作为实验对象,用METH急性刺激PC12细胞,检测Trx-1以及相关分子表达情况。研究发现,10 μM的METH对PC12细胞中Trx-1、CDK5. DARPP32的表达有具诱导作用,在2h表达最高,D1R、TH、MAO均无明显变化,而D2R的表达在12h和24 h显著上升。将C57BL/6小鼠分为四组：野生型对照组(C)、野生型甲基苯丙胺组(M)、h-Trx-1转基因型对照组(TG)、h-Trx-1转基因型甲基苯丙胺组(TG+M),腹腔注射甲基苯丙胺4h后,获取脑组织,结果发现在VTA、PFC、NAc中,Trx-1、D1R表达增加,同时D2R、DARPP-32表达减低。Trx-1高表达可以抵消这些作用。综上所述,METH急性刺激调节D1R、D2R、和DARPP-32等相关分子表达。Trx-1具有抑制这些分子的变化的作用,因此,进一步研究Trx-1调节甲基苯丙胺作用机制,为甲基苯丙胺成瘾戒断治疗提供新的理论依据。
【关键词】：甲基苯丙胺 硫氧还蛋白-1 多巴胺 多巴胺受体
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 缩略语索引15-16
• 第一章 绪论16-34
• 1.1 毒品和甲基苯丙胺16-17
• 1.1.1 甲基苯丙胺简介16-17
• 1.2 多巴胺和多巴胺受体17-18
• 1.3 DR在大脑中的作用18-20
• 1.3.1 DA具有增强突触生长作用18-19
• 1.3.2 DR在纹状体和前额叶皮质中调节神经突起生长19
• 1.3.3 DR调节前额叶皮质神经细胞的分裂和定向移动19-20
• 1.3.4 DA调节神经递质20
• 1.4 DR信号传导机制和METH作用机理20-23
• 1.4.1 DR的信号传导机制20-21
• 1.4.2 METH的相关作用机理21-23
• 1.5 硫氧还蛋白-123-24
• 1.5.1 硫氧还蛋白-1简介23-24
• 1.6 Trx-1的相关生物学功能24-30
• 1.6.1 抗氧化作用25-26
• 1.6.2 抑制细胞凋亡作用26
• 1.6.3 生长因子作用26-27
• 1.6.4 调节转录因子27
• 1.6.5 介导炎症反应27-28
• 1.6.6 促进蛋白质折叠28
• 1.6.7 Trx-1与肿瘤28-29
• 1.6.8 Trx-1与神经系统相关疾病29-30
• 1.7 CDK530-31
• 1.7.1 CDK5简介30
• 1.7.2 CDK5与药物成瘾30-31
• 1.8 DARPP-3231-32
• 1.9 本论文研究的目的及意义32-34
• 第二章 METH对Trx-1表达水平的影响及其信号通路研究34-52
• 2.1 引言34
• 2.2 实验方案34
• 2.3 实验材料34-40
• 2.3.1 实验细胞及药物34
• 2.3.2 主要试剂34-36
• 2.3.3 实验仪器36-37
• 2.3.4 主要试剂的配制37-40
• 2.4 实验方法40-46
• 2.4.1 细胞培养40-41
• 2.4.2 细胞排板与药物刺激41-42
• 2.4.3 提取细胞总蛋白42-43
• 2.4.4 细胞计数43-44
• 2.4.5 MTT实验44-46
• 2.4.6 统计学处理46
• 2.5 实验结果46-51
• 2.5.1 浓度依赖实验：METH对Trx-1最佳作用浓度的确定46
• 2.5.2 时间依赖实验：MTT检测PC12细胞存活率46-47
• 2.5.3 不同浓度METH对PC12细胞相关蛋白水平表达的影响47-51
• 2.6 小结51-52
• 第三章 METH调节小鼠各脑区蛋白表达52-62
• 3.1 引言52
• 3.2 实验方案52
• 3.3 材料与方法52-53
• 3.3.1 实验动物与器械52
• 3.3.2 C57BL/6小鼠饲养52-53
• 3.3.3 组织取材及保存53
• 3.3.4 小鼠脑组织中总蛋白的提取53
• 3.3.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)53
• 3.4 统计学处理53
• 3.5 实验结果53-61
• 3.5.1 METH给药对小鼠各脑区中Trx-1表达水平的影响54-56
• 3.5.2 METH给药对小鼠各脑区中D1R表达水平的影响56-58
• 3.5.3 METH给药对小鼠各脑区中D2R表达水平的影响58-59
• 3.5.4 METH给药对小鼠各脑区中DARPP-32表达水平的影响59-61
• 3.6 讨论61-62
• 第四章 结论与讨论62-66
• 4.1 结论62-63
• 4.1.1 确定PC12细胞中METH诱导Trx-1表达的最佳作用剂量62
• 4.1.2 确定PC12细胞中METH诱导Trx-1表达的最佳作用时间62
• 4.1.3 证明了甲基苯丙胺作用下Trx-1参与了多巴胺受体转导通路62
• 4.1.4 证明了甲基苯丙胺作用下DARPP-32的表达变化与硫氧还蛋白-1 存在一定相关性62-63
• 4.1.5 硫氧还蛋白-1与METH急性作用有关63
• 4.2 讨论63-66
• 致谢66-68
• 参考文献68-74
• 附录A74

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