基于内含肽的环境响应纳米载体的构建

发布时间：2017-06-07 10:24

  本文关键词：基于内含肽的环境响应纳米载体的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：环境响应性的药物递送载体在一定外界条件的刺激下,可以对所载药物的释放进行剂量、时间、空间的控制。这种给药方式能有效避免药物过早释放,提高靶点作用浓度,减少毒副作用,是纳米生物医药研究的热点和前沿。为了建立纳米载体控释新策略,本研究利用生物智能元件—内含肽特有的温度响应性自催化断裂活性,结合金纳米颗粒的光热转换性质,通过基因融合技术,以绿色荧光蛋白为载荷与内含肽融合、并在融合蛋白C端引入与金纳米颗粒高亲和的标签,一步法实现了金纳米颗粒的表面修饰与药物装载。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、非变性琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱分析结果证实融合蛋白高效地装载到了金纳米颗粒表面;SDS-PAGE和荧光光谱分析表明,该载体在40℃刺激下,能够实现载荷的可控释放。载荷释放后,内含肽仍结合于金纳米颗粒表面,维持其良好的生物相容性。在此基础上,针对融合蛋白质在金纳米颗粒表面装载的空间取向这一关键问题,本研究进一步探索了蛋白质与金纳米颗粒相互作用的规律。通过在金纳米颗粒表面装载不同性质的蛋白质,利用内含肽的温度响应性自催化断裂活性,分析了蛋白质自身性质对其在金纳米颗粒表面装载取向的影响。综上,本研究利用生物智能元件内含肽,构建了一种新型的温度响应性纳米载体,同时为研究蛋白质在纳米颗粒表面装载的空间取向提供了新的思路。
【关键词】：环境响应 控释 内含肽 空间取向 金纳米颗粒
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(武汉病毒研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 引言11-53
• 1.1 环境响应性药物递送载体11-25
• 1.1.1 环境响应性药物递送载体的概念11-12
• 1.1.2 纳米材料作为药物递送载体的优势12-13
• 1.1.3 环境响应性药物递送载体的分类13-25
• 1.1.3.1 温度响应的药物递送载体13-14
• 1.1.3.2 pH响应的药物递送载体14-16
• 1.1.3.3 光响应的药物递送载体16-18
• 1.1.3.4 氧化还原电势响应的药物递送载体18-20
• 1.1.3.5 磁场响应的药物递送载体20-22
• 1.1.3.6 酶分子响应的药物递送载体22-23
• 1.1.3.7 其他刺激响应的药物递送载体23-24
• 1.1.3.8 双重响应及多重响应的药物递送载体24-25
• 1.2 生物智能元件—内含肽25-39
• 1.2.1 内含肽的定义25-26
• 1.2.2 内含肽的剪接机制26-29
• 1.2.2.1 N-O键重排27-28
• 1.2.2.2 转酯作用28
• 1.2.2.3 Asn环化28
• 1.2.2.4 O-N键重组28-29
• 1.2.3 内含肽的分类29-30
• 1.2.4 内含肽在的生物学上的应用30-39
• 1.2.4.1 蛋白质的表达及分离纯化30-34
• 1.2.4.2 环肽的人工制备34
• 1.2.4.3 基因功能的研究和药物靶点34-35
• 1.2.4.4 蛋白质相互作用研究35-36
• 1.2.4.5 内含肽介导的蛋白质连接技术36-39
• 1.2.4.6 其他用途39
• 1.3 蛋白质/多肽药物递送的研究现状39-40
• 1.4 蛋白质和纳米颗粒的相互作用40-52
• 1.4.1 蛋白质与纳米颗粒相互作用的影响因素40-45
• 1.4.1.1 纳米颗粒的性质41-43
• 1.4.1.2 蛋白质的性质43-44
• 1.4.1.3 溶液因素44-45
• 1.4.2 蛋白质和纳米颗粒相互作用的研究意义45-46
• 1.4.3 蛋白质和纳米颗粒相互作用的表征参数46
• 1.4.4 蛋白质和纳米颗粒相互作用的研究方法46-48
• 1.4.5 蛋白质在纳米颗粒表面取向的研究现状48-51
• 1.4.6 超电荷绿色荧光蛋白简介51-52
• 1.5 本研究的主要目标及研究内容52-53
• 第2章 基于内含肽的环境响应纳米载体的构建53-87
• 2.1 材料与方法53-70
• 2.1.1 试验材料53-59
• 2.1.1.1 菌株和质粒53-55
• 2.1.1.2 主要仪器55-57
• 2.1.1.3 试剂与溶液配方57-59
• 2.1.2 方法59-70
• 2.1.2.1 表达载体pET32a-EGFPI及pET32a-mEGFPI的构建59-64
• 2.1.2.2 蛋白EGFPI及mEGFPI的表达和纯化64-65
• 2.1.2.3 温度和还原剂诱导的EGFPI蛋白的裂解反应65-67
• 2.1.2.4 金纳米颗粒的合成、修饰及表征67-68
• 2.1.2.5 货物蛋白在金纳米颗粒表面的装载68-69
• 2.1.2.6 内含肽介导的货物蛋白与载体的分离69-70
• 2.2 结果与分析70-85
• 2.2.1 表达载体pET32a-EGFPI和pET32a-mEGFPI的构建及验证70-72
• 2.2.2 融合蛋白EGFPI及mEGFPI的表达纯化72-73
• 2.2.3 EGFPI的裂解反应及产物鉴定73-76
• 2.2.4 金纳米颗粒的TEM表征76
• 2.2.5 金纳米颗粒吸收光谱测定76-77
• 2.2.6 载荷蛋白装载的琼脂糖凝胶电泳表征77-79
• 2.2.7 金-蛋白复合物的分离纯化79-80
• 2.2.8 货物装载效率计算80-81
• 2.2.9 货物释放的SDS-PAGE表征81-83
• 2.2.10 货物释放的荧光强度表征83-85
• 2.3 讨论与结论85-87
• 第3章 金纳米颗粒表面蛋白质取向的研究87-101
• 3.1 材料和方法87-93
• 3.1.1 材料87-90
• 3.1.1.1 质粒与菌株87-90
• 3.1.1.2 主要仪器90
• 3.1.1.3 试剂与溶液配方90
• 3.1.2 方法90-93
• 3.1.2.1 表达载体的构建pET32a-MBPI，pET32a-GSTI，pET32a- (-30)EGFPI，pET32a-(+15)EGFPI90-92
• 3.1.2.2 GSTI，MBPI，-30GFPI，+15GFPI蛋白的表达及纯化92
• 3.1.2.3 内含肽介导的融合蛋白的裂解反应92
• 3.1.2.4 蛋白质在金纳米颗粒表面的装载及释放92-93
• 3.2 结果与分析93-100
• 3.2.1 表达载体pET32a-MBPI，pET32a-GSTI，pET32a-(-30)EGFPI， pET32a-(+15)EGFPI的构建和验证93-96
• 3.2.2 融合蛋白MBPI，，GSTI，-30GFPI，+15GFPI的表达纯化96
• 3.2.3 融合蛋白的裂解反应96-97
• 3.2.4 蛋白质在金纳米颗粒表面的取向分析97-100
• 3.3 讨论与结论100-101
• 参考文献101-118
• 附录118-125
• 附录1 缩略词表118-119
• 附录2 金纳米颗粒浓度计算表119-120
• 附录3 金纳米颗粒粒径计算表120
• 附录4 金纳米颗粒表面裂解产物的二级质谱图120-121
• 附录5 融合蛋白序列121-123
• 附录6 金纳米颗粒表面裂解产物的色谱分离图123-124
• 附录7 金纳米颗粒的合成124-125
• 作者简历125

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