影响E.coli FtsZ自身组装及其与MreB相互作用的重要氨基酸分析

发布时间：2017-06-08 03:03

  本文关键词：影响E.coli FtsZ自身组装及其与MreB相互作用的重要氨基酸分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景由于抗生素的大量使用,细菌产生耐药性已成为临床上常见的问题,导致很多的致病菌对抗生素产生抵抗力。抗生素的滥用不仅造成了药品资源的浪费,还增加了患者的经济负担,更重要的是使人体菌群失衡免疫力下降并促进耐药菌株的产生。因此寻找新的抗细菌的药物靶点、开发新型药物相当重要。细菌在分裂和形成子细胞的过程中,需要很多蛋白质共同参与。细菌分裂时起必需作用的蛋白对于细菌的生存和增殖是不可缺少的,而且这类蛋白在形态上很保守并且很难变异,因此成为很有希望的新型抗细菌药物研发的靶点。细菌的分裂和特定形态的维持受多种蛋白的调节,比如FtsZ、FtsA、ZapA、MreB等,其中微管蛋白类似物FtsZ和肌动蛋白类似物MreB起核心作用,但具体的机制目前未完全清楚,这限制了以FtsZ为靶点进行新一代抗生素的开发和利用。FtsZ是E.coli等细菌分裂所必需的蛋白,高度保守于原核生物中。FtsZ单体通过纵向和横向(侧面)相互作用形成束状聚合物,最后在菌体中部形成Z环。Z环的稳定需要FtsA、ZipA、ZapA和ZapB等多种蛋白的参与,其最终起骨架作用,通过招募下游与细胞分裂有关的多种蛋白,在即将分裂的菌体细胞中部形成分裂体(divisome),调控细菌的分裂。分裂体收缩使得分裂蛋白复合物形成隔膜,最后细菌的细胞平均分配母体的遗传物质,形成两个相同的子细胞。MreB是现在公认的控制E.coli形态的主要蛋白。在真核生物中,生物的形状和运动性是通过周期性调节肌动蛋白骨架网的聚合和解聚来完成的,而在细菌中,MreB是肌动蛋白类似物,它可以在细胞外围聚合成细丝,并协调细菌细胞壁的合成。其基因敲除后会影响细胞壁的合成,可导致E.coli菌体由杆状变为球状,但当菌体内FtsZ高水平表达,可抑制MreB缺陷所引起的形态改变。近年来有研究者发现,FtsZ特殊位点氨基酸的突变可致菌体呈马蹄形、新月形和鹿角形等;另外也有研究者发现,MreB的某些突变体可致细菌的异常分裂,说明FtsZ与MreB间存在某种协调关系,但相关机制目前报道较少。为进一步探讨FtsZ和MreB是否共同调控细菌的生长和分裂,通过对不同细菌的FtsZ分析,我们发现它们氨基酸序列高度同源。本研究以埃希氏大肠杆菌为模式生物,通过分析其FtsZ的三维结构和二维结构,发现E75、R78和D82这三个氨基酸位于FtsZ侧面H3结构域,且可能参与FtsZ(74-82)区域两性螺旋结构的形成和FtsZ单体的侧面组装,而且E75、R78和D82氨基酸位于两性螺旋结构的同一侧。推测E75、R78和D82可能是影响H3结构和FtsZ胞内组装的重要氨基酸。我们通过对E75、R78和D82特定氨基酸位点进行突变,观察其对FtsZ胞内组装、定位和FtsZ-MreB相互作用的影响,初步探索相关的作用机制,对以FtsZ为靶点进行新一代抗菌药物的研发提供一定的帮助。在我们实验中,使用活细胞成像技术、免疫沉淀和细菌双杂交等方法检测二者可能在调控细菌的正常生长和分裂中共同发挥作用。目的探索E.coli FtsZ突变体FtsZE75A、FtsZR78G和FtsZD82A对FtsZ自身组装和FtsZ-MreB相互作用的影响。方法1.利用常规分子克隆和定点突变技术,构建FtsZ及其突变体表达载体,亲和纯化后得到相应的目标蛋白。2.通过同源重组构建QN6(ftsZ::yfp-cat)、QN7(ftsZE75A::yfp-cat)、QN8(ftsZR78G::yfp-cat)和QN9(ftsZD82A::yfp-cat)菌株。3.利用活细胞成像技术观察FtsZ及其突变体的胞内定位模式。4.免疫沉淀和细菌双杂交实验检测FtsZ/FtsZ*-FtsZ*或FtsZ/FtsZ*-MreB间的相互作用。5.光扫描检测定点突变后对FtsZ组装特性的影响。结果1.FtsZE75A、FtsZR78G和FtsZD82A突变体的功能活性降低、各突变体在E.coli内不能正确的定位和形成功能性Z环。2.FtsZ/FtsZ*-FtsZ*单体间的相互作用减弱或消失,FtsZ*-MreB相互作用破坏。3.FtsZ突变体在体外聚合效率降低。结论FtsZ E75、R78和D82是影响FtsZ正确组装和功能及FtsZ-MreB相互作用的重要氨基酸。
【关键词】：大肠埃希氏菌(E.coli) FtsZ组装 MreB 细胞内定位
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R978
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词表12-14
• 引言14-16
• 1 前言16-18
• 2 材料、实验试剂与仪器18-28
• 2.1 材料与试剂18-19
• 2.2 仪器19-20
• 2.3 部分试剂配制20-28
• 3 实验方法28-44
• 3.1 质粒的提取28
• 3.2 细菌的冻存28-29
• 3.3 重组质粒的构建29-32
• 3.4 细菌基因组DNA的提取32
• 3.5 普通感受态制备32-33
• 3.6 电穿孔感受态制备33-34
• 3.7 普通转化34
• 3.8 电穿孔转化34-35
• 3.9 细菌菌体沉淀回收35
• 3.10 菌体细胞的裂解35-36
• 3.11 SDS-PAGE凝胶电泳36
• 3.12 WESTERN BLOT36-37
• 3.13 透析袋的处理37-38
• 3.14 蛋白纯化（1ml HP 柱子）38-39
• 3.15 HP柱子再生39
• 3.16 原核蛋白的诱导表达39
• 3.17 OVERLAP PCR39-41
• 3.18 活细胞成像技术41
• 3.19 同源重组法构建菌株41
• 3.20 免疫共沉淀41-42
• 3.21 细胞双杂交试验42
• 3.22 光扫描法42
• 3.23 平板补偿实验42
• 3.24 生长曲线分析42-44
• 4 实验结果44-54
• 4.1 FTSZ突变体位点选择与设计44
• 4.2 FTSZ及其突变体表达质粒的构建（详细构建信息见附录 1）44-46
• 4.2.1 pQN1( P_(lac)-ftsZ )质粒的构建44-45
• 4.2.2 FtsZ突变体表达质粒的构建[以pQN2(P_(lac)-fts~(E75A))为例]45-46
• 4.3 同源重组构建QN6、QN7、QN8和QN9菌株（构建结果以QN6为例）46-47
• 4.3.1 ftsZ::yfp-cat融合基因片段的制备46
• 4.3.2 QN6(ftsZ::yfp-cat)菌株的构建46-47
• 4.4 E75、R78和D82是影响FTSZ在E.COLI中形成Z环的重要氨基酸47-48
• 4.5 补偿实验验证FTSZ突变体功能48
• 4.6 E75、R78和D82是影响FTSZ自身组装的重要氨基酸48-51
• 4.6.1 免疫共沉淀实验验证E75、R78和D82是影响FtsZ自身组装的重要氨基酸48-49
• 4.6.2 构建带His标签的FtsZ及其突变体融合质粒并表达纯化49-50
• 4.6.3 光扫描实验验证E75、R78和D82是影响FtsZ自身组装的重要氨基酸50-51
• 4.7 E75、R78和D82位点氨基酸极性改变影响FTSZ-MREB相互作用51-54
• 4.7.1 pUT18C-fts Z表达质粒的构建（XbaⅠ/BamHⅠ）51-52
• 4.7.2 pKT25-mreB表达质粒的构建（XbaⅠ/EcoRⅠ）52-53
• 4.7.3 E75、R78和D82位点氨基酸极性改变影响FtsZ-MreB相互作用53-54
• 讨论54-56
• 结论56-58
• 参考文献58-60
• 综述60-72
• 参考文献67-72
• 附录72-80
• 致谢80-82
• 在读期间参加的学术会议及研究成果82-83

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1 霍雨佳;影响E.coli FtsZ自身组装及其与MreB相互作用的重要氨基酸分析[D];河南大学;2016年

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本文编号：431128