靶向肿瘤干细胞抗体偶联药物AC133-L1-MMAF的构建及其药效学实验研究

发布时间：2017-07-03 01:13

  本文关键词：靶向肿瘤干细胞抗体偶联药物AC133-L1-MMAF的构建及其药效学实验研究

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【摘要】：肿瘤细胞群体中具有自我更新能力和分化潜能的小部分肿瘤细胞被称之为肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs),它是肿瘤发生、增殖、转移和治疗抵抗的“种子细胞”,临床证据也显示肿瘤干细胞可能是肿瘤演进的根源。肿瘤干细胞的发现和证实为肿瘤的高效治疗提供了新的契机,促使我们重新考察传统的恶性肿瘤治疗策略。因此,靶向肿瘤干细胞的特异性杀伤有望为改善恶性肿瘤疗效带来新的希望,而用于分离和鉴定肿瘤干细胞的特异性标记为高效的主动靶向提供了潜在位点。基于此,本文提出利用筛选肿瘤干细胞的特异性抗体构建抗体-药物偶联物(Antibody-drug conjugate,ADC)靶向性杀伤肿瘤的策略,以期极大地提高肿瘤治疗效果。本课题以结肠癌为例,选用可抑制微管组装而影响细胞有丝分裂的强细胞毒素阿里他汀(Auristatins)的衍生物Monomethyl Auristatin F(MMAF)作为ADC的偶联药物;选用结肠癌干细胞表面的特异标记CD133分子的抗体AC133作为偶联抗体,构建靶向结肠癌干细胞的抗体偶联药物。合成、纯化和表征ADCs药物AC133-L1-MMAF(L1:Maleimidocaproyl-val-cit-pABC)后,以CT-26细胞为研究对象,体外分析评价AC133-L1-MMAF对CD133+细胞的主动靶向性和细胞毒性;构建CB-17/SCID小鼠体内移植瘤模型,评价ADC体内抗肿瘤活性。通过本课题的研究,不仅能为肿瘤治疗提供全新的策略,还能为针对肿瘤细胞不同分化型态给药提供实验和理论依据。本课题主要内容和结果有:(1)选用小鼠结肠癌干细胞上的标记物CD133抗体anti-CD133(AC133)作为偶联抗体,以细胞微管类毒素药物阿里他汀的衍生物MMAF作为偶联药物,以maleimidocaproyl-val-cit-p ABC作为链接子,合成抗体偶联药物AC133-maleimidocaproyl-val-cit-pABC-MMAF(AC133-L1-MMAF);通过SDS-PAGE、RP-HPLC等表征AC133与L1-MMAF偶联。SDS-PAGE实验结果表明,单抗AC133在连接上MMAF之后分子量增大;RP-HPLC结果表明:在单抗AC133的特征吸收波长280nm处出现两个吸收峰,查阅文献得知依次为抗体的轻链和重链,在MMAF的最大吸波长220nm处并无吸收峰出现,而ADC在220nm和280nm处均检测到吸收峰,出峰时间相近。由以上结果可说明AC133与L1-MMAF连接成功;(2)以小鼠结肠癌细胞CT-26为研究对象,通过MTT法检测ADC、DOX和L1-MMAF对CT-26细胞的毒性。实验结果表明,给药72h后ADC的IC50值为0.182±0.004nM,而72h后L1-MMAF的IC50值为2.642±0.179u M,DOX为8.986±0.163uM,与L1-MMAF和DOX比较,统计学差异显著,表明ADC对CT-26/CD133+细胞有更强的毒性;以相同浓度的ADC、DOX和L1-MMAF处理CT-26/CD133+细胞和鼠嗜铬细胞瘤细胞pc12/CD133-细胞发现,ADC对CD133+细胞有更强的毒性;通过免疫荧光标记法分别检测ADC-AF488对未被饱和的CD133+细胞和被饱和的CD133+细胞的结合能力,实验发现ADC与未饱和CD133+细胞结合后细胞表面荧光强度较高,而经过AC133饱和后的CD133+细胞表面几乎检测不到荧光,表明ADC对CD133+细胞具有良好的靶向结合能力;以流式细胞术检测经过ADC和DOX处理后的CT-26细胞群体中CD133+细胞的比例,结果表明经过ADC处理后CT-26细胞中CD133+比例降低约0.7%,而经DOX处理后的CT-26细胞群体中CD133+比例并无显著变化,进一步说明ADC靶向性杀伤CD133+细胞;Western blotting结果显示ADC处理能上调胞内Jak信号通路蛋白p-STAT3的表达;(3)利用小鼠结肠癌细胞构建SCID小鼠皮下移植瘤模型,小鼠肿瘤成瘤率约为90%。采用尾部静脉注射给药,通过小鼠肿瘤体积变化,体重变化,药物抑瘤率以及生存实验评价不同剂量的ADC、L1-MMAF和DOX的体内活性。实验结果表明,当ADC剂量为4mg/kg时模型小鼠体重稳定,肿瘤生长受抑制程度最大,最高仅为200mm3左右,给药结束后肿瘤不断变小直至几乎消失(80d),其次为2mg/kg的ADC组和DOX(8mg/kg)组,肿瘤生长均受到不同程度的抑制,且很大程度上延长了小鼠的生存时间,与4mg/kg ADC组相比差异显著(p0.05)。分别取给药组(4mg/kg ADC)和对照组小鼠的肿瘤组织作病理切片观察,HE染色结果表明病理切片为正常肿瘤组织切片,其中给药组肿瘤细胞死亡区域较多,核膜溶解情况严重,对照组小鼠肿瘤细胞排列有序,细胞形态良好;肿瘤切片免疫组化实验结果并未发现明显CD133阳性表达。
【关键词】：肿瘤干细胞 抗体偶联药物 靶向性 结肠癌 移植瘤
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 缩略词表10-11
• 1 绪论11-15
• 1.1 课题提出11-12
• 1.2 研究内容12-13
• 1.2.1 AC133-L1-MMAF的合成与连接结构鉴定12-13
• 1.2.2 AC133-L1-MMAF的体外活性鉴定13
• 1.2.3 ADC体内药效学实验研究13
• 1.3 技术路线13-15
• 2 抗体偶联药物的合成与表征15-23
• 2.1 材料及仪器15-16
• 2.1.1 主要材料试剂15
• 2.1.2 仪器15-16
• 2.1.3 相关溶液配制16
• 2.2 AC133-L1-MMAF的合成与鉴定16-18
• 2.2.1 合成AC133-L1-MMAF16-17
• 2.2.2 抗体偶联药物纯化17
• 2.2.3 药抗比率（drug/antibody ratio, DAR）测定17
• 2.2.4 偶联物分子量鉴定17-18
• 2.2.5 RP-HPLC18
• 2.3 实验结果18-22
• 2.3.1 SDS-PAGE18-19
• 2.3.2 偶联比测定19-20
• 2.3.3 RP-HPLC分析20-22
• 2.4 小结及讨论22-23
• 3 AC133-L1-MMAF体外药效学实验23-37
• 3.1 材料及仪器23-24
• 3.1.1 材料及试剂23
• 3.1.2 主要仪器及耗材23-24
• 3.1.3 相关溶液配制24
• 3.2 AC133-L1-MMAF细胞活性研究24-25
• 3.2.1 细胞实验相关操作24-25
• 3.2.2 细胞毒性检测25
• 3.3 AC133-L1-MMAF对CT-26 细胞靶向性表征25-26
• 3.3.1 AC133-L1-MMAF靶向杀伤性实验25
• 3.3.2 AC133-L1-MMAF亲和性实验25-26
• 3.4 流式细胞术检测26
• 3.4.1 细胞给药处理26
• 3.4.2 流式分析26
• 3.5 Western Blot26-27
• 3.5.1 STAT3及p-STAT3蛋白提取26
• 3.5.2 Western Blot操作26-27
• 3.6 结果27-34
• 3.6.1 AC133-L1-MMAF细胞活性研究27-31
• 3.6.2 ADC对CD133+细胞靶向性评价31-34
• 3.6.3 STAT3及p-STAT3表达变化34
• 3.7 小结及讨论34-37
• 4 Anti-CD133-L1-MMAF体内药效实验研究37-47
• 4.1 材料及仪器37-38
• 4.1.1 主要试剂及相关溶液配制37
• 4.1.2 主要耗材及仪器37-38
• 4.2 实验过程38-40
• 4.2.1 构建免疫缺陷型小鼠移植瘤模型38
• 4.2.2 实验设计及给药38
• 4.2.3 指标检测38-39
• 4.2.4 组织学观察39-40
• 4.3 实验结果40-45
• 4.3.1 接种细胞活性检测40
• 4.3.2 荷瘤小鼠生长状态40-42
• 4.3.3 AC133-L1-MMAF体内活性表征42-44
• 4.3.4 病理观察及免疫组化结果44-45
• 4.4 小结及讨论45-47
• 5 结论与展望47-49
• 5.1 主要结论47-48
• 5.2 后续工作及建议48-49
• 6 文献综述49-59
• 6.1 抗体偶联药物的研究进展49-56
• 6.1.1 市场现状49-54
• 6.1.2 抗体偶联药物分类54-56
• 6.2 抗体偶联药物作用机制与缺陷56-57
• 6.3 影响抗体偶联药物的因素57-59
• 6.3.1 抗体偶联药物分子大小57
• 6.3.2 连接药物的选择57
• 6.3.3 linker的选择57-58
• 6.3.4 药物对肿瘤细胞的毒性58
• 6.3.5 肿瘤标志物的特异性58-59
• 致谢59-61
• 参考文献61-69
• 附录69
• 硕士期间发表论文69
• 主持和参与的科研项目69

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