γ-聚谷氨酸高产菌株的选育及培养基的优化

发布时间：2017-07-29 11:23

  本文关键词：γ-聚谷氨酸高产菌株的选育及培养基的优化

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【摘要】：γ-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基脱水缩合连接而成的一种新型生物高分子材料,其具有卓越的吸水性能,最大吸水比例可达1:3500,这一性质使其在化妆品、医药辅料、妇婴用品等领域得以广泛应用。此外,γ-聚谷氨酸还具有良好的生物相容性、延展性、可塑性等特点,极具开发及应用潜力。但目前其菌种产率较低、生产成本较高,这在一定程度上限制了其在各领域的应用及发展。本实验旨在建立一种灵敏、简便的γ-聚谷氨酸含量检测方法,诱变选育出一株高产γ-聚谷氨酸的菌株,并通过优化其培养基成分及培养条件,达到降低生产成本的目的。本文以十六烷基三甲基溴化铵可在碱性条件下与γ-聚谷氨酸形成络合物为理论基础,通过考察其络合时间、络合浓度及所用氢氧化钠浓度等因素,最终确定了比浊法检测γ-聚谷氨酸浓度的最佳条件为:十六烷基三甲基溴化铵浓度为6g/L,氢氧化钠浓度为4%,最佳络合时间为3min,检测波长为250nm。在此条件下,建立标准曲线,方程为y=0.03245x-0.12367,R2为0.9977,重现性良好。采用豆粕作为基础培养基,分别对碳源种类、碳氮比、氨基酸及氨基酸盐、无机盐离子、接种量、PH值等因素进行单因素试验,筛选出对γ-聚谷氨酸的产量影响较显著的四个因素分别为:氨基酸及氨基酸盐、无机盐离子、pH值和接种量。通过四因素、三水平正交试验,得到了最佳组合为谷氨酸6%,无机盐离子添加量为0.2%,PH值为7.2,接种量为5%,以此组合进行验证试验,得到γ-聚谷氨酸的产量为62.40mg/g比未优化之前的47.21mg/g提高了32.18%。对实验室保藏菌株HG-009进行了物理诱变、化学诱变及复合诱变等诱变手段来提高γ-聚谷氨酸的产量。其中以紫外20W、10cm的条件诱变60s,将γ-聚谷氨酸的产量由61.31mg/g提升到69.04mg/g。然后通过2%的DES 15min诱变,将γ-聚谷氨酸的产量由61.90mg/g提升到71.39mg/g。之后采用500W微波诱变25s,使γ-聚谷氨酸产量由62.22mg/g提升至71.88mg/g。最后以各单因素的最佳条件为基础进行复合诱变,将γ-聚谷氨酸的产量由62.40mg/g提高至72.87mg/g。而总体而言,通过各诱变因素与培养基优化,γ-聚谷氨酸总共提高了54.35%。运用苯酚-硫酸法测定了γ-聚谷氨酸发酵物中多糖的含量,得出了其含量及所占比例的变化趋势,即随着γ-聚谷氨酸高产菌株的选育,多糖含量从81.2mg/g增加至87.3mg/g,增幅为7.5%。这一变化可能与菌株的诱变选育过程中生长代谢增强有关,这一研究,为γ-聚谷氨酸在实际生产中的除杂、分离纯化提供了参考,为γ-聚谷氨酸的发酵产物的成分及其含量的分析提供了新的思路。
【关键词】：γ-聚谷氨酸 高分子 生物相容性 诱变选育
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 主要符号表13-14
• 第一章 前言14-24
• 1.1 γ-聚谷氨酸14-17
• 1.1.1 简介14
• 1.1.2 主要性质14-15
• 1.1.2.1 分子结构14
• 1.1.2.2 物理化学性质14-15
• 1.1.3 γ-聚谷氨酸的生产方法15-16
• 1.1.4 γ-聚谷氨酸工程菌研究进展16-17
• 1.2 γ-聚谷氨酸定性定量分析方法17-18
• 1.2.1 γ-聚谷氨酸测定方法研究现状17
• 1.2.2 差值法17-18
• 1.2.3 直接法18
• 1.2.4 γ-PGA--CTAB 复合物比浊法18
• 1.3 γ-聚谷氨酸菌株诱变育种18-19
• 1.3.1 物理诱变19
• 1.3.2 化学诱变19
• 1.3.3 诱变育种筛菌方法19
• 1.4 γ-聚谷氨酸发酵条件及发酵样品研究19-20
• 1.4.1 固体发酵条件研究19-20
• 1.4.2 γ-聚谷氨酸产品纯化及保存方法研究20
• 1.5 γ-聚谷氨酸应用20-23
• 1.5.1 γ-聚谷氨酸在农业上的应用20-21
• 1.5.2 γ-聚谷氨酸在食品工业中的应用21
• 1.5.3 γ-聚谷氨酸在水果保鲜中的应用21
• 1.5.4 γ-聚谷氨酸在地质研究及地震预测中的应用21-23
• 1.6 本研究的目的和意义23-24
• 1.6.1 目的23
• 1.6.2 意义23-24
• 第二章 γ-聚谷氨酸测定方法研究24-34
• 2.1 材料与方法24-29
• 2.1.1 实验材料24-26
• 2.1.2 差值法26
• 2.1.2.1 标准曲线的测定26
• 2.1.2.2 γ-聚谷氨酸含量的测定26
• 2.1.3 CTAB比浊法26-28
• 2.1.3.1 CTAB比浊法标准曲线的测定26-27
• 2.1.3.2 γ-聚谷氨酸含量的测定27-28
• 2.1.4 直接法28
• 2.1.4.1 吸光度与γ-聚谷氨酸标准曲线的测定28
• 2.1.4.2 γ-聚谷氨酸含量的测定28
• 2.1.5 直接称重法28-29
• 2.2 结果与分析29-33
• 2.2.1 差值法测发酵液中γ-聚谷氨酸的检测29
• 2.2.2 γ-PGA-CTAB复合物比浊法的测定结果29-31
• 2.2.3 直接法标准曲线的绘制31-32
• 2.2.4 粗品直接称重法操作步骤32-33
• 2.3 讨论33-34
• 第三章 以豆粕为主要原料生产γ-PG A发酵条件的优化34-46
• 3.1 材料与方法35-38
• 3.1.1 实验材料35
• 3.1.2 菌种的筛选、活化及发酵产物的定性35-36
• 3.1.3 固体发酵条件的优化36-38
• 3.1.3.1 碳源的选择36-37
• 3.1.3.2 碳源添加比例的选择37
• 3.1.3.3 氨基酸及氨基酸盐对的γ-聚谷氨酸的影响37
• 3.1.3.4 无机盐离子对γ-PGA产量的影响37
• 3.1.3.5 PH的选择对γ-PGA产量的影响37
• 3.1.3.6 接种量对γ-PGA产量的影响37-38
• 3.1.3.7 固体发酵条件的正交试验优化38
• 3.2 结果与分析38-45
• 3.2.1 分离菌株特征结果分析38-39
• 3.2.2 γ-聚谷氨酸固体发酵条件优化结果分析39-45
• 3.2.2.1 碳源的选择39-40
• 3.2.2.2 碳氮源比例的选择40-41
• 3.2.2.3 氨基酸及氨基酸盐的选择41-42
• 3.2.2.4 添加无机盐选择42
• 3.2.2.5 pH的选择42-43
• 3.2.2.6 接种量的选择43
• 3.2.2.7 正交试验优化结果43-45
• 3.3 讨论45-46
• 第四章 γ-聚谷氨酸高产菌株的选育46-60
• 5.1 材料与方法47-50
• 5.1.1 实验材料47
• 5.1.2 γ-聚谷氨酸菌种子生长曲线的测定47
• 5.1.3 菌悬液的制备47
• 5.1.4 紫外诱变47-48
• 5.1.5 初筛方法48
• 5.1.6 复筛方法48
• 5.1.7 DES诱变48-49
• 5.1.8 初筛方法49
• 5.1.9 复筛方法49
• 5.1.10复合诱变49
• 5.1.11初筛方法49
• 5.1.12复筛方法49
• 5.1.13 复合诱变49-50
• 5.1.14 初筛方法50
• 5.1.15 复筛方法50
• 5.2 结果与分析50-58
• 5.2.1 种子生长曲线的测定50
• 5.2.2 紫外诱变菌株致死率和正向突变率50-52
• 5.2.3 紫外诱变筛选菌株结果分析52
• 5.2.4 DES 诱变52-54
• 5.2.5 微波诱变54-57
• 5.2.6 复合诱变57
• 5.2.7 复筛出高产菌的传代稳定性研究57-58
• 5.3 讨论58-60
• 第五章 γ-聚谷氨酸发酵产物的成分分析60-63
• 4.1 材料与方法60-61
• 4.1.1 实验材料60
• 4.1.2γ-聚谷氨酸发酵液的制备60-61
• 4.1.3 γ-聚谷氨酸发酵液中多糖的分析方法61
• 4.2 结果与分析61-62
• 4.2.1 苯酚硫酸法测多糖标准曲线的建立61-62
• 4.2.2 γ-聚谷氨酸发酵液结果分析62
• 4.3 讨论62-63
• 第六章 结论63-64
• 参考文献64-68
• 致谢68-69
• 个人简历、在学习期间的研究成果及发表的学术论文69

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