长春新碱和奎宁共载脂质体的制备及逆转肿瘤耐药性作用研究

发布时间：2017-08-09 23:12

  本文关键词：长春新碱和奎宁共载脂质体的制备及逆转肿瘤耐药性作用研究

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【摘要】：长春新碱是一种一线抗癌药物,常以硫酸盐形式存在,临床应用广泛,但是长春新碱对神经系统尤其是外周神经的毒性以及易产生耐药性限制了其在临床上的应用。奎宁是传统的抗疟药物,但是已有研究发现其具有耐药逆转作用。因此,为了提高长春新碱对耐药肿瘤的治疗作用并减少毒副作用,本论文在探讨奎宁逆转多药耐药机理的基础上,制备了长春新碱与奎宁共载的脂质体。具体研究工作分成以下几个部分：本论文首先探讨了奎宁在A549/T、HCT-8/V和MCF-7/A三种耐药细胞中的逆转耐药机制,主要考察了奎宁对细胞中ATP含量及ATP酶活性的影响和奎宁对耐药细胞中耐药蛋白P-gp表达的影响。实验结果表明奎宁可以降低三种耐药细胞中ATP的含量并能降低细胞中ATP酶活性,证明奎宁是P-gp蛋白的底物。另外奎宁并能降低三种耐药细胞中P-gp蛋白的表达量,显示出显著的耐药逆转作用。基于长春新碱和奎宁的溶解度,本论文以大豆磷脂和胆固醇为原料,用薄膜水化法制备了长春新碱和奎宁的共载脂质体,采用了Sephadex G-50凝胶柱层析法分离脂质体与游离药物以测定脂质体的包封率,过程中以pH为7.4的PBS缓冲液为流动相进行洗脱,之后采用溶剂甲醇对脂质体结构进行破坏,使药物逸出后,分别用HPLC法和UV法测定分离前后脂质体中的长春新碱和奎宁的含量,计算两种药物的载药量和包封率。同时考察了两种药物和磷脂的比例变化对包封率和载药量的影响,发现长春新碱和奎宁的比例为1：2时,包封率和载药量都相对较高,因此筛选为最佳的处方,用于后续实验。继而考察了脂质体的一系列理化性质,包括外观、粒径、电位和形态,结果显示制备好的脂质体的粒径为62.47nm, PDI为0.283,另外考察脂质体的体外药物释放行为,发现随着pH的降低,长春新碱和奎宁在PBS种的释放速率都有所增加,且不管是药物共载脂质体还是单载脂质体混合,两种药物之间的释放基本不会相互干扰。随后本论文考察了共载脂质体的体内外抗肿瘤效果。首先通过MTT实验测定了各个处方组对A549/T、HCT-8/V和MCF-7/A三种耐药细胞的细胞毒性,结果表明共载脂质体在三种耐药细胞上都有很强的逆转耐药效果,IC50达到0.095±0.008μg/mL、1.36±0.25μg/mL和2.95 ± 1.17μg/mL。同时考察了A549/T细胞、HCT-8/V细胞和MCF-7/A细胞在1h、2h、4h和8h四个时间点对长春新碱的摄取,通过HPLC方法测定细胞中长春新碱的含量,发现共载脂质体组可以提高细胞对长春新碱的摄取。其次通过摸索,本论文构建了A549/T细胞球模型和MCF-7/A细胞球模型,进一步考察了各处方组对细胞球的毒性,发现长春新碱和奎宁共载脂质体相比其他组而言,同样具有更强的细胞毒性。最后通过A549/T细胞裸鼠荷瘤模型,考察各组别药物对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制作用。结果显示,长春新碱和奎宁共载脂质体对肿瘤的抑制效果显著优于游离药物组和脂质体共混组,抑瘤率达到84.0%,体现了共载脂质体在提高体内抑瘤作用上的优势。综上,长春新碱和奎宁的共载脂质体能够有效装载药物,并对A549/T、 HCT-8/V和MCF-7/A肿瘤的耐药性显示出显著逆转作用,制备长春新碱和奎宁的共载脂质体具有一定的应用前景和临床意义。
【关键词】：长春新碱 奎宁 脂质体 共载 多药耐药性 耐药逆转 P-gp
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 缩略语10-15
• 前言15-20
• 第一章 奎宁逆转耐药的机制的初步探讨20-35
• 1.1 材料与仪器20-22
• 1.1.1 材料20-22
• 1.1.2 仪器22
• 1.2. 实验方法22-27
• 1.2.1 ATP含量测定22-24
• 1.2.2 P-gp相关的ATP酶活性实验24-25
• 1.2.3 Western Blot实验测定P-gp蛋白表达量25-27
• 1.3 实验结果27-32
• 1.3.1 ATP含量测定27-29
• 1.3.2 P-gp相关的ATP酶活性实验29-31
• 1.3.3 Western Blot实验测定P-gp蛋白表达31-32
• 1.4 讨论32-34
• 1.5 本章小结34-35
• 第二章 长春新碱与奎宁共载脂质体的制备、表征及体外释放35-57
• 2.1 材料与仪器35-37
• 2.1.1 材料35-36
• 2.1.2 仪器36-37
• 2.2 实验方法37-51
• 2.2.1 脂质体的制备38
• 2.2.1.1 空白脂质体的制备38
• 2.2.1.2 硫酸长春新碱的脱盐反应38
• 2.2.1.3 载药脂质体的制备38
• 2.2.2 硫酸长春新碱的含量测定方法38-41
• 2.2.2.1 检测波长的选择39
• 2.2.2.2 色谱条件的确定39
• 2.2.2.3 色谱行为39-40
• 2.2.2.4 线性范围的考察40-41
• 2.2.3 一盐酸奎宁的含量测定方法41-42
• 2.2.3.1 检测波长的选择41
• 2.2.3.2 干扰排除41
• 2.2.3.3 线性范围的考察41-42
• 2.2.4 脂质体包封率的测定及脂质体的纯化方法42-47
• 2.2.4.1 Sephadex G-50柱层析法分离脂质体和游离药物的方法建立43-46
• 2.2.4.2 Sephadex G-50柱层析法测定脂质体包封率46-47
• 2.2.4.3 膜过滤法联合透析法纯化脂质体47
• 2.2.5 脂质体制备中药物比例的筛选47-48
• 2.2.6 长春新碱与奎宁共载脂质体的粒径、粒径分布及电位测定48
• 2.2.7 长春新碱与奎宁共载脂质体的形态观察48
• 2.2.8 单载脂质体和共载脂质体的体外释放行为48-51
• 2.2.8.1 体外释放样品分析测定方法的建立48-50
• 2.2.8.2 脂质体体外释放行为的考察50-51
• 2.3 实验结果与讨论51-55
• 2.3.1 单载脂质体和共载脂质体的制备51
• 2.3.2 脂质体制备中药物比例的筛选51-52
• 2.3.3 长春新碱与奎宁共载脂质体的粒径及电位测定52-53
• 2.3.4 长春新碱与奎宁共载脂质体的形态观察53
• 2.3.5 单载脂质体和共载脂质体的体外释放行为53-55
• 2.4 本章小结55-57
• 第三章 长春新碱与奎宁共载脂质体的体外及体内抗肿瘤效果评价57-82
• 3.1 材料与仪器57-60
• 3.1.1 材料57-59
• 3.1.2 仪器59-60
• 3.2 实验方法60-69
• 3.2.1 细胞毒性实验60-62
• 3.2.2 细胞对脂质体的摄取实验62-64
• 3.2.2.1 细胞培养62-63
• 3.2.2.2 样品处理方法63
• 3.2.2.3 提取回收率的考察63
• 3.2.2.4 线性范围的考察63
• 3.2.2.5 细胞对各处方中长春新碱的摄取情况63-64
• 3.2.3 体外多细胞肿瘤球实验64-66
• 3.2.3.1 扫描电镜(SEM)观察多细胞肿瘤球形态64-65
• 3.2.3.2 多细胞肿瘤球增长抑制实验65-66
• 3.2.4 体内抗肿瘤药效研究66-69
• 3.2.4.1 裸鼠的A549/T肿瘤模型构建66
• 3.2.4.2 裸鼠体内抗肿瘤药效研究66-67
• 3.2.4.3 肿瘤组织的免疫组化检查67-69
• 3.3 实验结果与讨论69-80
• 3.3.1 细胞毒性实验69-72
• 3.3.2 细胞对脂质体的摄取实验72-75
• 3.3.3 体外多细胞肿瘤球实验75-77
• 3.3.3.1 扫描电镜(SEM)观察多细胞肿瘤球形态75
• 3.3.3.2 多细胞肿瘤球增长抑制实验75-77
• 3.3.4 体内抗肿瘤药效研究77-80
• 3.3.4.1 裸鼠体内抗肿瘤药效研究77-79
• 3.3.4.2 肿瘤组织的免疫组化检查79-80
• 3.4 本章小结80-82
• 全文总结82-84
• 参考文献84-91
• 综述91-112
• 参考文献105-112
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果112

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：647761