JD增强低剂量紫杉醇对人胃癌的体内外抗肿瘤作用及其机制研究

发布时间：2017-08-18 01:29

  本文关键词：JD增强低剂量紫杉醇对人胃癌的体内外抗肿瘤作用及其机制研究

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【摘要】：JD是由冬凌草甲素(冬凌草活性成分)的结构改造而来,经初步抗肿瘤活性评价发现JD对胃癌细胞株具有较好的抑制和杀伤作用,但机制尚不清楚。紫杉醇抗癌疗效显著,然而正常剂量下的紫杉醇长期用药会出现明显的毒副反应和耐药性,并且随着给药剂量的加大,不良反应与毒副作用会更加严重,进而限制了紫杉醇在临床上的应用。联合用药是目前临床治疗中一种重要的给药方案,具有增强单一药物的疗效,降低单一药物的用药剂量等优势,因此在胃癌的治疗中寻求一种与紫杉醇配伍、高疗效、低毒性的联合疗法意义重大。本论文设计将JD与低剂量紫杉醇联用,降低紫杉醇的用药剂量,进而达到减毒增效的目的。具体研究内容如下：1.用MTT法体外评价JD与紫杉醇分别单独用药对MKN45细胞的杀伤效果。结果发现JD单独用药和紫杉醇单独用药,都能时间和浓度依赖性的抑制MKN45细胞体外增殖。2.用中效分析的方法评价JD和低剂量紫杉醇在胃癌MKN45细胞中的相互作用关系。发现实验浓度下的JD与低剂量紫杉醇联合用药CI值小于1,表明JD和低剂量的紫杉醇联合用药表现出协同作用,其中紫杉醇(5 nM)和JD (20 μM)联用效果较好。3.用克隆形成实验检测JD与紫杉醇单独用药和联合用药对单个MKN45细胞体外增殖能力的影响。发现与二者单独用药相比,JID与紫杉醇联合用药可协同抑制MKN45细胞克隆的形成(p0.01),形成的克隆体更小,克隆数更少。4.通过流式细胞术检测药物作用后的细胞凋亡率。JD(20μM)、紫杉醇(5μM)及二者联用作用于MKN45细胞的凋亡率分别是(22.65±2.07)%、(13.12±1.75)%、(54.73±3.10)%。与低剂量的紫杉醇单独用药相比,JD与低剂量紫杉醇联合用药可显著诱导MKN45细胞凋亡的增加(p0.01)。5.利用Western blotting方法检测凋亡相关的蛋白表达变化。与单用低剂量紫杉醇相比,JD与低剂量紫杉醇联合用药可使促凋亡蛋白Bax、t-Bid、Puma、 Cleaved-caspase 9和Cleaved-caspase 3的表达水平明显上调(p0.05)；使抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、PI3Kp110α、p-AKT、Raptor和p-p70S6K的表达水平显著下调(p0.05)。6.利用siRNA转染技术进行Bax基因敲除,检测Bax在凋亡相关通路中的作用。发现两者协同抑制MKN45细胞增殖的能力明显减弱(p0.05)；另外,加入Caspase 9抑制剂(Z-LEHD-FMK)后,两者协同诱导细胞凋亡的作用也显著降低(p0.05)。7.建立胃癌MKN45细胞裸鼠移植瘤模型,检测JD联用低剂量紫杉醇的治疗效果。与单用低剂量紫杉醇治疗组相比,JD与紫杉醇联合用药组对肿瘤的生长抑制效果更明显(p0.05),可接近单用紫杉醇正常剂量组的治疗效果,而且在实验过程中各给药组裸鼠体重的变化没有明显差异(p0.05)。8.利用HE染色观察肿瘤组织在不同药物处理情况下病理学的变化。HE染色结果显示,与单用低剂量紫杉醇治疗组相比,JD与低剂量紫杉醇联合用药组的细胞和组织呈现更多的坏死和萎缩。9.利用TUNEL染色观察各处理组肿瘤组织中的细胞凋亡情况。TUNEL染色结果显示,与单用低剂量紫杉醇治疗组相比,JD与低剂量紫杉醇联合组细胞凋亡的数量明显增多。10.利用Western blotting方法检测肿瘤组织中凋亡相关的蛋白表达变化。Western blotting的结果显示,与低剂量紫杉醇单独用药相比,JD与低剂量紫杉醇联合用药后,可明显促进促凋亡蛋白Bax、t-Bid、Cleaved-caspase 9、Puma、和Cleaved-caspase 3的表达(p0.05)；而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、 PI3Kp110、p-AKT、Raptor和p-p70S6K的表达(p0.05)。本实验说明冬凌草甲素Oridonin的衍生物JD和低剂量紫杉醇联合用药对人胃癌MKN45细胞的体内外抗肿瘤作用起协同作用,并且JD和低剂量紫杉醇发挥协同抗肿瘤作用是通过诱导MKN45细胞凋亡而实现的。JD和低剂量紫杉醇协同诱导MKN45细胞凋亡的机制可能是通过激活线粒体信号通路,同时抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路而实现的。
【关键词】：JD 紫杉醇 联合治疗 人胃癌MKN45细胞 抗肿瘤
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文缩略词表9-12
• 1 前言12-24
• 1.1 胃癌的研究现状12-13
• 1.2 紫杉醇的抗癌作用与不良反应13-14
• 1.2.1 紫杉醇抗癌作用的研究进展13-14
• 1.2.2 紫杉醇治疗中产生的不良反应14
• 1.3 冬凌草甲素Oridonin的抗癌作用研究进展14-16
• 1.4 线粒体凋亡通路研究进展16-17
• 1.5 PI3K/AKT/mTOR通路研究进展17
• 1.6 紫杉醇参与的联合治疗策略17-18
• 1.7 本课题研究的内容18-20
• 参考文献20-24
• 2 JD增强低剂量紫杉醇对人胃癌的体内外抗肿瘤作用及机制研究24-63
• 2.1 实验材料与试剂24-30
• 2.1.1 细胞株和实验验用裸鼠24-25
• 2.1.2 实验用主要试剂25-27
• 2.1.3 实验主要仪器27
• 2.1.4 相关试剂配制27-30
• 2.2 实验方法30-40
• 2.2.1 细胞培养30-31
• 2.2.2 细胞存活实验31-32
• 2.2.3 克隆形成实验32-33
• 2.2.4 流式细胞术分析33
• 2.2.5 Western blotting33-37
• 2.2.6 siRNA转染37-38
• 2.2.7 建立裸鼠移植瘤模型38-39
• 2.2.8 HE和TUNEL染色39
• 2.2.9 统计学分析39-40
• 2.3 结果40-58
• 2.3.1 JD单用和PTX单用均能时间和剂量依赖性抑制MKN45细胞体外增殖40-41
• 2.3.2 JD与低剂量PTX联合用药协同抑制MKN45细胞增殖41-43
• 2.3.3 JD与低剂量PTX联合用药协同抑制MKN45细胞克隆形成43-44
• 2.3.4 JD可增强低剂量PTX诱导的MKN45细胞凋亡44-51
• 2.3.5 JD增强低剂量PTX对荷瘤裸鼠的抗肿瘤效应51-53
• 2.3.6 体内模型中,JD增强低剂量PTX诱导的MKN45肿瘤细胞凋亡53-58
• 2.4 讨论58-60
• 2.5 结论60-61
• 参考文献61-63
• 个人简历及科研情况63-64
• 致谢64

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本文编号：692087