蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯ATPR诱导K562细胞分化中的作用

发布时间：2017-09-11 09:37

  本文关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯ATPR诱导K562细胞分化中的作用

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【摘要】：蛋白酪氨酸磷酸酶(Shp2)是最早被定义为癌基因的酪氨酸磷酸酶,参与多种细胞信号转导通路,其突变与不同类型的白血病及实体瘤的发生密切相关。全反式维甲酸(all trans retinoic acid, ATRA)作为分化诱导剂的代表已广泛应用于临床上治疗急性早幼粒性白血病。但长期使用ATRA会导致维甲酸综合征、耐药性等不良反应,制约了其在临床上广泛应用。课题组前期对ATRA的碳链末端进行结构改造,获得一系列衍生物,经过大量药效学筛选,发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate, ATPR)具有较强的生物学活性,可诱导多种肿瘤细胞分化成熟,有望成为一种新型诱导分化剂。本研究在确证ATPR诱导慢性粒细胞白血病K562细胞分化作用的基础上,利用小分子干扰RNA(siRNA)技术干扰K562细胞中Shp2基因,建立Shp2表达沉默模型,旨在观察Shp2在ATPR诱导K562细胞分化过程中所起的作用,阐明ATPR抗肿瘤作用的可能机制。目的：观察蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在新型维甲酸衍生物ATPR诱导慢性粒细胞白血病K562分化过程中所起的作用。方法：1.ATPR对K562细胞增殖分化及Shp2表达的影响：选取慢性粒细胞白血病K562细胞为实验对象,CCK-8法观察ATPR对K562细胞增殖的影响：瑞氏吉姆萨染色观察细胞形态学变化；流式细胞仪检测细胞周期和特异性分化抗原CD235a的表达；采用Q-RT-PCR和Western blot技术检测K562细胞中蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2mRNA和蛋白的表达。2.采用siRNA干扰技术构建Shp2沉默模型：通过化学合成法合成特异性荧光短链Shp2 siRNA-FAM,使用Lipofectamine 2000转染试剂盒将Shp2 siRNA转染入K562细胞,采用荧光显微镜、Western Blot法检测siRNA转染效率及其对Shp2蛋白表达的抑制作用,选取最佳Shp2 siRNA-FAM。3.Shp2沉默对ATPR诱导K562分化作用的影响：实验分组：空白对照组(RPMI-1640)、阳性药对照组ATRA(浓度为10-5mol/L)、实验组ATPR组(浓度为10-5mol/L)、Shp2沉默不加药组(siRNA-lipo)、siRNA-lipo+ATRA组以及siRNA-lipo+ATPR组。CCK-8法观察ATPR对K562细胞增殖的影响；瑞氏-吉姆萨染色法在倒置相差显微镜下观察加药处理前后细胞形态学变化：采用流式细胞仪测定细胞周期的变化及特异性分化指标CD235a的表达变化。4.Shp2沉默对ATPR诱导维甲酸受体表达的影响：分为空白对照组(等体积RPMI-1640)、阳性药对照组ATRA(浓度为10-5mol/L)、实验组ATPR组(浓度为10-5mol/L)、Shp2沉默不加药组(siRNA-lipo)、siRNA-lipo+ATRA组以及siRNA-lipo+ATPR组。采用Q-PCR和Western Blot法检测ATPR对K562细胞维甲酸受体mRNA表达和蛋白水平的影响。结果：1.ATPR (10-5mol/L)作用72h后,观察K562细胞,与对照组比较,细胞形态学出现明显变化,细胞向分化成熟方向变化；细胞周期方面,细胞S期所占比例减少,细胞Go/G1期所占比例增多,细胞滞留在Go/G1期；细胞特异性分化抗原CD235a表达明显升高；K562细胞中Shp2的mRNA和蛋白的表达均明显下降。2.实验设计的3条Shp2-siRNA链均能成功转染入K562细胞,其中siRNA-A链(PTPN-Homo-438)和siRNA-C (PTPN-Homo-1493)转染入K562细胞效果更好,且Western Blot结果显示,PTPN-Homo-438与lipo比例为1：0.05时Shp2蛋白表达最低,故选用此条件进行转染。3.ATPR(10-5mol/L)作用于转染沉默Shp2的K562细胞72h后,CCK-8法结果显示ATPR能抑制K562细胞的增殖,但当Shp2被转染沉默后ATPR对K562细胞的增殖抑制作用不明显；瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学变化显示当Shp2被转染沉默后,ATPR对K562的作用没有出现单独使用ATPR时所出现的形态学变化；流式细胞术结果显示ATPR用药后K562细胞Go/G1期细胞所占比例增加,S期所占比例减少,但当Shp2表达沉默后,变化不明显；流式细胞仪检测特异性分化指标CD235a的表达变化也出现类似情况。4.ATPR (10-5mol/L)作用72h后,Q-RT-PCR和Western Blot结果显示,与对照组相比,在K562细胞中,RARa的表达降低,RARγ表达升高,RARβ的表达变化不明显。当Shp2被转染沉默后,RARα、RARγ的mRNA表达和蛋白水平与空白组相比均没有明显变化。结论：1.ATPR对慢性粒细胞白血病K562细胞具有诱导分化的作用。2.siRNA-A链(PTPN-Homo-438)沉默K562细胞中Shp2基因效果较好。3.沉默Shp2可抑制ATPR诱导K562细胞分化的作用。
【关键词】：4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯 蛋白酪氨酸磷酸酶 K562细胞 白血病 诱导分化 维甲酸受体
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 英文缩略词5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 第一部分 ATPR对K562细胞的诱导分化作用及其Shp2表达的影响13-38
• 1 前言13-15
• 2 实验材料15-17
• 3 实验方法17-25
• 4 结果25-32
• 5 讨论32-34
• 6 小结34
• 参考文献34-38
• 第二部分 蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2沉默后4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯诱导K562细胞分化作用的影响38-57
• 1 前言38-39
• 2 实验材料39-41
• 3 实验方法41-45
• 4 实验结果45-53
• 5 讨论53-54
• 6 小结54-55
• 参考文献55-57
• 附录57-58
• 致谢58-60
• 综述60-76
• 参考文献70-76

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