二氢杨梅素铵盐对小鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-04-27 09:20

【摘要】：目的研究新药二氢杨梅素铵盐对急、慢性酒精性肝损伤小鼠的解酒醒脑及保肝作用,并初步探讨其作用机制。方法1.将SPF级C57BL/6J小鼠分为5组,即空白对照组(正常小鼠),模型组(酒精组),二氢杨梅素组(5 mg/kg,DHM组),二氢杨梅素铵盐低剂量组(5 mg/kg,低TDHM组),二氢杨梅素铵盐高剂量组(10 mg/kg,高TDHM组)。DHM组及低、高TDHM组均予以相应剂量药物灌胃,空白对照组、酒精组予以等体积生理盐水灌胃,30 min后,酒精组及各药物组予56°白酒(0.25 m L/20 g)灌胃,建立急性酒精性中毒模型。观察各组小鼠的醉酒状态及酒精耐受时间、宿醉时间。6小时后处死小鼠,比色法检测外周血AST、ALT变化,ELISA法检测肝组织中ADH、ALDH和脑组织中β-EP、LENK浓度。2.将SPF级C57BL/6J小鼠分为5组,分组情况同上,参照NIAAA模型(Gao-Binge模型),建立慢性酒精性肝病模型。各组均予对照饲料适应饲养5天,接着酒精组与药物组均更换为含5%酒精液体饲料,每日上午各药物组予相应剂量灌胃处理10天,次日清晨酒精组与DHM组及低、高TDHM组均予以31.5%乙醇灌胃,正常空白组予以45.0%麦芽糖糊精溶液灌胃,9小时后处死小鼠。每日观察小鼠的精神状态、体重变化等一般情况,HE、油红O染色观察各组小鼠肝脏组织病理学变化,比色法检测肝组织AST、ALT活力,生化检测TG、ADH、ALDH水平,ELISA检测肝组织SOD、MDA浓度,Western-blot法测定CYP2E1的表达。结果1.二氢杨梅素铵盐对急性酒精中毒小鼠解酒保肝作用结果:(1)行为学观察:低TDHM组、高TDHM组与酒精组相比(41.40±21.03min,50.90±35.83min vs 11.30±8.16min)均可延长小鼠醉酒时间(p0.001,p0.01),且均较DHM组(41.40±21.03min,50.90±35.83min vs17.70±15.55min)显著(p0.05)。高TDHM组小鼠醒酒时间最短(152.40±46.04 min vs 256.71±36.54min,p0.001),DHM组、低TDHM组也较酒精组小鼠醒酒时间(188.40±49.09min,172.40±45.66min vs 256.71±36.54min)缩短(p0.01),各TDHM组与DHM组之间无明显统计学差异。(2)血清ALT、AST水平:DHM组,高TDHM组ALT活力较酒精组(10.70±3.08,8.58±4.83 vs 17.72±6.84)明显下降(p0.05),各TDHM组与DHM组间无明显统计学差异。DHM组及低、高TDHM组AST活力较酒精组(45.35±10.17,33.02±2.68,32.21±8.11 vs 64.12±15.00)均明显下降(p0.05,p0.001,p0.01),低、高TDHM药物组均较DHM组作用效果显著(p0.05)。(3)肝组织匀浆ADH、ALDH浓度:与酒精组相比DHM组及低、高TDHM组ADH浓度(0.38±0.02,0.51±0.13,0.49±0.06 vs 0.30±0.06)均可提高(p0.05,p0.01,p0.001),且低、高TDHM组较DHM组作用显著(p0.01)。低、高TDHM组ALDH浓度较酒精组相比(13.38±3.85,15.99±5.91 vs 7.40±4.47)均明显提高(p0.05),且低、高TDHM组较DHM组(13.38±3.85,15.99±5.91 vs 7.86±3.15)作用显著(p0.05)。(4)脑组织匀浆β-EP、LENK浓度:与酒精组相比,DHM组及低、高TDHM组(324.82±25.54,309.83±32.55,283.89±38.42 vs 384.28±39.83)均可下调脑组织β-EP水平(p0.05,p0.01,p0.01),各TDHM组与DHM组间无明显统计学差异。各组小鼠LENK浓度之间无明显统计学差异。2.二氢杨梅素铵盐对慢性酒精性肝损伤小鼠的保肝作用结果:(1)HE染色及油红O染色病理学改变:与对照组相比酒精组小鼠肝组织发生严重的脂肪变性,DHM组与低、高TDHM组脂肪变性轻于酒精组。(2)肝组织TG含量:与酒精组相比,DHM组、低TDHM组TG水平(0.08±0.007,0.08±0.004 vs 0.11±0.02)明显降低(p0.05,p0.01),且低TDHM组较DHM组降低明显(p0.05)。(3)肝组织中ALT、AST水平:酒精组小鼠肝组织ALT、AST水平明显减低,DHM组与低TDHM组ALT水平较酒精组(2.14±0.52,2.12±0.56 vs 1.51±0.17)明显升高(p0.05),各TDHM组与DHM组间无明显统计学差异。与酒精组相比,DHM组及低、高TDHM组AST水平(5.00±0.42,5.53±0.38,5.57±0.82 vs 3.97±0.45)升高(p0.01,p0.001,p0.01),且低TDHM组较DHM组升高明显(p0.05)。(4)肝组织ADH、ALDH活力:与酒精组相比低、高TDHM组ADH水平(25.02±12.13,23.16±13.33 vs 10.18±3.26)均可提高(p0.05)。与酒精组相比DHM组及高TDHM组ALDH水平(74.54±14.56,82.77±20.93 vs 56.02±14.17)均升高(p0.05),低DHM组升高显著(105.18±25.45 vs 56.02±14.17,p0.01),且较DHM组作用明显(p0.05)。(5)肝组织MDA、SOD浓度:与酒精组相比,DHM组及低、高TDHM组MDA(40.28±1.48,35.30±4.82,34.88±4.36 vs 47.29±4.35),明显降低(p0.01,p0.01,p0.001),低、高TDHM组较DHM组降低明显(p0.05)。与酒精组相比,低、高TDHM组(8.63±0.98,8.76±2.91 vs 5.55±1.10)可提高SOD水平(p0.001,p0.05),各TDHM组与DHM组间无明显统计学差异。(6)肝组织CYP2E1水平:与酒精组相比DHM组及低、高TDHM组均可降低CYP2E1水平(p0.05,p0.01,p0.01),低、高TDHM组较DHM组作用明显(p0.05,p0.01)。结论1.同DHM一样,TDHM对急性酒精中毒小鼠有解酒、促醒作用,其作用机制可能与减少肝细胞损伤,提高代谢及降低脑组织β-EP有关,并且解酒醒脑作用较DHM显著。2.同DHM一样,TDHM对慢性酒精性肝损伤有保护作用,其作用机制可能与减少肝细胞破坏,提高代谢,降低TG、MDA、CYP2E1水平,起到抗氧化、减少氧自由基有关,并且保护作用优于DHM。3.TDHM作为DHM的水溶性衍生物,可提高药物生物利用度,有望成为ALD的新一代预防与治疗药物。
【图文】：

它在临床运用的价值[9]。如若想使得 DHM 的是生物活性充分发挥，首要问题需改善提高它的水溶性，如果水溶性提高，那么会更加显示出它的生物活性优势。很多学者为提高其水溶性，也相继研制出 DHM 相关衍生物，本研究团队前期合成了一种 DHM 衍生物，二氢杨梅素铵盐（ammonium dihydromyricetin，TDHM），化学分子式为：(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮，分子量为 421，化学结构式见图 1-b，它的水溶解度达 6500mg/L，而 DHM 的水溶解度不超过 263.54mg/L，较 DHM 显示出良好的溶解度，该药物已获得美国专利（专利号：US.9139551B2），但其是否能在保持 DHM 的解酒、保肝、抗氧化、抗纤维化作用的前提下，提高 DHM 生物利用度为酒精相关性疾病防治提供新的选项，是我们要探讨的内容。本研究采用具亲酒性 C57BL / 6J 小鼠，，进行酒精灌胃胃造模，相似于人类饮酒模式。通过体内实验，初步探讨 TDHM 对酒精性肝损伤的解酒保肝作用及其机制。

图 2 醉酒小鼠翻正反射消失 对急性酒精性中毒小鼠醉酒时间的影响精灌胃后，酒精组小鼠很快出现醉酒状态，出现画圈不稳，呼吸、心率加快、翻正反射消失，二便失禁等为醉酒时间（min）,研究显示各药物组小鼠的醉酒状HM 组、高 TDHM 组较酒精组（41.40±21.03min，5min）醉酒状态明显延迟（p＜0.001；p＜0.01），并且酒时间也晚于 DHM 组小鼠（41.40±21.03min vs170±35.83min vs17.70±15.55min，p＜0.05），如图 3
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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