奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因（SCD1）启动子功能及转录调控机理研究

发布时间：2018-03-17 20:29

  本文选题：奶山羊　切入点：脂肪酸代谢　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：山羊奶富含短、中链脂肪酸以及多种不饱和脂肪酸,具有独特的营养价值和保健功能。反刍动物泌乳期乳腺脂肪酸代谢是影响乳中脂肪酸组成的重要生理过程。硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)是乳腺中脂肪酸去饱和化的关键酶,它可以利用棕榈酸和硬脂酸催化生成棕榈油酸和油酸,这些单不饱和脂肪酸是构成乳中甘油三酯的重要成分。因此,山羊SCD1基因的功能及表达调控机理研究对羊奶成分及品质调控具有重要理论意义和实际应用价值。在奶山羊乳腺组织SCD1基因功能分析的基础上,本研究通过克隆并分析SCD1启动子的结构和功能,研究该基因在山羊乳腺上皮细胞中的转录调控机理。利用腺病毒介导的过表达和siRNA介导的干扰技术,分析SCD1基因在乳腺上皮细胞中的功能;克隆了山羊SCD1基因5'侧翼序列,利用生物信息学分析SCD1启动子的结构与功能。并通过定点突变、过表达或干扰转录因子分别研究了转录因子SREBP1,LXRα,PPARG和外源因子亚油酸对山羊SCD1基因的转录调控机理。本研究的主要结果如下:1.构建SCD1基因腺病毒过表达载体,包装出高滴度的SCD1过表达腺病毒(Ad-SCD1)。将腺病毒感染山羊乳腺上皮细胞,与对照组相比,过表达SCD1显著上调细胞中甘油三酯含量,以及FASN,DGAT2,GPAM,FABP3和PPARΑ基因的mRNA水平(P0.05),并显著下调PNPLA2,LIPE,CD36和CPT1B基因的表达(P0.05)。同时,过表达SCD1显著上调了C16:1和C18:1的去饱和指数(P0.05)。2.设计合成针对SCD1基因的siRNA序列,检测其干扰效率。当乳腺细胞转染靶向SCD1基因的siRNA后,显著下调乳腺细胞中总甘油三酯的含量。实时定量结果表明,与对照组结果相比,干扰SCD1基因降低FASN,ACACA,LPIN1,DGAT1,DGAT2,LIPE,FABP3,PPARΑ和ACOX1基因的表达量(P0.05),并显著上调CD36和CPT1B基因的表达(P0.05)。同时,干扰SCD1基因下调了C18:1的去饱和指数(P0.05),但是对C16:1的去饱和指数没有影响。3.克隆得到山羊SCD1基因5'侧翼序列1778 bp。通过生物信息学分析发现,SCD1启动子含有TATA-box,位于转录起始位点上游49 bp处,是构成真核生物启动子的元件之一。在线预测软件分析发现SCD1启动子含有NF-Y、AP-2、PPAR、SREBP、C/EBP和ER等多个转录因子结合位点。启动子片段缺失分析结果表明,SCD1启动子核心区域位于 411~ 355 bp。同时,启动子核心区域存在Sp1、SRE和NF-Y等顺式作用元件。4.定点缺失突变分析发现,单个缺失SRE或NF-Y元件,SCD1启动子基础活性与野生型相比显著下降。过表达SREBF1对SCD1基因的表达量和启动子活性都有上调作用。干扰SREBF1抑制SCD1基因的表达并下调SCD1启动子活性。将NF-Y单独突变或与SRE同时突变后,过表达SREBF1对SCD1启动子活性没有影响。因此,SREBP1通过SRE和NF-Y元件调控SCD1启动子活性。5.LXRα激动剂T0901317处理乳腺细胞能够上调SCD1基因的表达水平以及C16:1和C18:1的去饱和指数。干扰LXRα对SCD1基因的mRNA水平没有影响。干扰SREBF1同时添加T0901317显著上调SCD1基因的表达。LXRα过表达引起SCD1启动子转录活性上调,但干扰LXRα对启动子活性没有影响。生物信息学预测SCD1启动子存在两个LXRE位点。通过片段缺失和定点突变分析发现,突变LXRE不能阻止LXRα过表达对SCD1启动子活性的诱导作用。但是突变SRE和NF-Y元件后,LXRα过表达对SCD1启动子活性没有影响。干扰SREBF1后,LXRα过表达不能上调SCD1启动子活性。SREBP1是维持SCD1启动子基础转录活性的必需因子,LXRα则间接调控SCD1基因的转录活性。6.亚油酸处理山羊乳腺上皮细胞,结果发现SREBF1和SCD1基因的mRNA水平显著下降,SCD1启动子活性也显著下调。PUFA应答元件在山羊、人和小鼠中非常保守。通过片段缺失和定点突变分析发现,NF-Y元件突变后亚油酸对SCD1启动子活性无显著影响。当SCD1启动子上PUFA应答元件内SRE位点突变后,亚油酸处理细胞,同时添加T0901317对SCD1启动子活性没有影响。亚油酸参与调控SCD1基因的转录活性是通过抑制SREBP1的表达发挥作用的。7.过表达PPARG1,同时用PPARG特异性激动剂ROSI处理乳腺细胞,SCD1基因的mRNA水平及启动子活性显著上调(P0.05)。通过片段缺失分析发现,SCD1启动子上-29 bp处的PPRE位点对PPARG1的诱导具有重要作用,且该位点在山羊,人和小鼠上的保守性比较高。进一步对其进行突变分析发现,该元件是PPARG上调SCD1启动子活性所必需的元件。本研究表明,山羊SCD1能够促进乳腺上皮细胞中脂质的积累。并发现山羊SREBP1对SCD1基因有直接转录调控作用,而LXRα通过诱导SREBP1的表达间接调控SCD1基因转录。外源因子亚油酸则通过多种机制抑制SREBP1的表达来调控SCD1基因转录。转录因子PPARG能够直接结合在SCD1启动子上诱导其转录。本研究阐明了脂质代谢相关重要转录因子和外源因子参与调控SCD1基因转录的机制,为羊奶脂肪酸代谢调控机理研究奠定基础。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
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本文编号：1626350