水稻耐旱性调控网络关键调节基因的克隆及OsERF65的功能研究

发布时间：2022-08-13 14:37

　　作为世界主要粮食作物之一,水稻（Oryza sativa L.）的稳产、高产对保障粮食安全具有至关重要的意义。水稻在生产过程中对水分有极大需求,然而,我国水资源匮乏,旱灾频发,随着全球环境恶化与气候异常加剧了旱灾的程度,这使得水稻的生产受到非常严峻的挑战。因此,挖掘水稻抗旱基因,探究水稻抗旱机理,从而培育具有节水抗旱特性的水稻品种,对于稳定粮食安全十分重要。转录调控因子通过调控一系列下游基因的转录,在植物生长发育、抵御逆境等方面发挥重要作用,因此挖掘与鉴定水稻中与抗旱性相关的转录调控因子,对培育节水抗旱稻（WDR）具有重要价值。本实验室前期选取了不同抗旱类型的典型材料,进行了耐旱性分析和转录组测序分析,获得了多个耐旱性基因共表达网络的节点。本文对其中的5个编码转录调控因子的基因进行克隆和转基因材料的创制。并对其中一个编码AP2/ERF转录因子的Os ERF65基因进行了详细的功能研究。主要结果如下:1. 对5个编码转录调控因子的耐旱候选基因进行了基因克隆、超表达载体和CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建,并且利用农杆菌转化法对日本晴水稻进行了遗传转化,通过分子鉴定获得了相应的转基因... 

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写名词表
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 植物的抗旱性
        1.2.1 植物抗旱性的类型
        1.2.2 植物抗旱性的鉴定指标
            1.2.2.1 形态指标
            1.2.2.2 生长指标
            1.2.2.3 生理生化指标
    1.3 植物在非生物胁迫下的应答调控
        1.3.1 植物对非生物胁迫应答的一般途径
        1.3.2 植物激素在植物非生物胁迫信号传递中的作用
            1.3.2.1 ABA在植物非生物胁迫信号传递中的作用
            1.3.2.2 乙烯在植物非生物胁迫信号传递中的作用
    1.4 植物中ERF转录因子研究进展
        1.4.1 AP2/ERF转录因子家族结构特征与分类
        1.4.2 AP2/ERF转录因子家族在植物应对非生物胁迫时的作用
            1.4.2.1 AP2/ERF家族在植物应对干旱胁迫时的作用
            1.4.2.2 AP2/ERF家族在植物应对其他非生物胁迫中的作用
    1.5 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 水稻材料
    2.2 菌株与载体
    2.3 耐旱候选基因的筛选、克隆及生物信息学分析
    2.4 载体构建与遗传转化
        2.4.1 耐旱候选基因超量表达载体的构建
        2.4.2 耐旱候选基因CRISPR/Cas9 敲除载体的构建
        2.4.3 遗传转化
    2.5 表达量检测
        2.5.1 RNA提取及cDNA合成
        2.5.2 实时定量PCR
    2.6 转基因植株检测
        2.6.1 超表达转基因植株的分子鉴定
        2.6.2 CRISPR/Cas9 敲除转基因植株的分子鉴定
    2.7 用于候选基因表达模式分析的材料
    2.8 水稻材料苗期抗逆性鉴定
    2.9 水稻抗逆性相关生理指标的检测
        2.9.1 过氧化氢含量的测定
        2.9.2 丙二醛含量的测定
        2.9.3 脯氨酸含量的测定
    2.10 转基因植株转录组测序分析
        2.10.1 转录组测序
        2.10.2 差异表达基因的验证
    2.11 目标蛋白的亚细胞定位分析
        2.11.1 烟草叶片瞬时表达
        2.11.2 水稻原生质体瞬时表达
    2.12 酵母细胞中的生化实验
        2.12.1 酵母中的反式激活活性鉴定
        2.12.2 酵母双杂交
3 结果与分析
    3.1 水稻耐旱性转录因子的挖掘和转基因植株的构建
        3.1.1 转基因植株耐旱性转录组分析及候选基因挖掘
        3.1.2 耐旱候选基因的克隆、超量表达和基因敲除载体的构建及水稻遗传转化
        3.1.3 耐旱候选基因超表达转基因植株的分子鉴定
        3.1.4 耐旱候选基因敲除转基因植株的分子鉴定
    3.2 水稻耐旱候选基因OsERF65的功能研究
        3.2.1 OsERF65序列分析
        3.2.2 OsERF65蛋白序列比对与聚类分析
        3.2.3 OsERF65基因上游启动子的转录调控元件分析
        3.2.4 OsERF65在逆境下的表达模式分析
        3.2.5 OsERF65蛋白的亚细胞定位和转录激活活性分析
        3.2.6 OsERF65的转基因植株的获得
        3.2.7 OsERF65超表达材料的耐旱性分析
        3.2.8 oserf65突变体材料的耐旱性分析
        3.2.9 OsERF65转基因植株的转录组测序分析
        3.2.10 下游DEGs启动子的顺式作用元件分析
        3.2.11 OsERF65互作蛋白的筛选及验证
        3.2.12 Os ERF65在WDR中的表达模式分析
4 讨论
    4.1 OsERF65正调控水稻的耐旱性
    4.2 Os ERF65 编码一个典型的ERF转录因子
    4.3 OsERF65的表达受非生物逆境胁迫的诱导
    4.4 Os ERF65对WDR育种的意义
参考文献
附录
    附录Ⅰ 附图
    附录Ⅱ 附表
    附录Ⅲ 部分实验的详细操作程序
    附录Ⅳ 作者简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3677219