驼乳和牛乳乳清蛋白抗菌肽的制备及其抗菌活性的比较研究
发布时间：2020-05-08 08:29
【摘要】：马驼乳具有丰富的营养价值和较高的药用价值,其乳清蛋白中含有丰富的保护性蛋白,且含有较高活性的抗菌因子。本研究以驼乳和牛乳乳清蛋白为原料,研究了胃蛋白酶及胰蛋白酶的酶解工艺,确定了最适酶解条件;采用超滤技术对酶解得到的多肽进行初步分离,通过葡聚糖凝胶层析得到了具有抗菌活性的乳清蛋白肽,本文的主要试验结果如下:1.以抑菌率为评价指标,利用响应面法优化技术对胃蛋白酶和胰蛋白酶制备抑菌肽的工艺进行了优化。获得胃蛋白酶最佳酶解驼乳乳清蛋白工艺参数:酶解温度为40.16℃、酶解pH为3.00、酶解时间为5.36 h,酶解底物浓度为4%,酶与底物浓度比为1:100,抑菌率为84.03%;获得胃蛋白酶最佳酶解牛乳乳乳清蛋白工艺参数:酶解温度为39.24℃、酶解pH为3.00、酶解时间为4.89 h,酶解底物浓度为4%,酶与底物浓度比为1:100,抑菌率为82.11%;获得胰蛋白酶最佳酶解驼乳乳清蛋白工艺参数:酶解温度为45.36℃、酶解pH为8.58、酶解时间为3.57 h,酶解底物浓度为4%,酶与底物浓度比为1:100,抑菌率为73.01%;获得胰蛋白酶最佳酶解牛乳乳清蛋白工艺参数:酶解温度为40.96℃、酶解pH为7.78、酶解时间为3.93 h,酶解底物浓度为4%,酶与底物浓度比为1:100,抑菌率为73.56%;通过SDS-电泳鉴定了水解程度,得出驼乳相较于牛乳更易被蛋白酶水解从而证明其更易消化吸收。2.对酶解液进行超滤和葡聚糖凝胶层析纯化处理,得出具有较强抑菌活性的组分,分别为胃蛋白酶酶解驼乳和牛乳乳清蛋白抗菌肽组分G-25-2和G-25-2'以及胰蛋白酶酶解驼乳和牛乳乳清蛋白抗菌肽组分G-25-2和G-25-1 '。3.氨基酸分析结果表明,驼乳胃蛋白酶的G-25-2组分中疏水性氨基酸(65.76%)及碱性氨基酸(32.8%)的含量均高于牛乳的G-25-2'组分(分别为51.77%和31.77%);驼乳胰蛋白酶的G-25-2组分中碱性氨基酸(28.13%)的含量高于牛乳的G-25-1'组分(25.07%),但其疏水性氨基酸(51.29%)的含量低于牛乳的G-25-1'组分(57.69%)。在本试验中发现,驼乳胃蛋白酶G-25-2的抑菌肽组分中脯氨酸的含量(32.34%)显著高于其它抗菌肽组分中脯氨酸的含量(p0.05),进一步说明了驼乳胃蛋白酶抗菌肽的抑菌活性强于牛乳抗菌肽。4.分子量分析结果表明,胃蛋白酶酶解的驼乳和牛乳抗菌肽组分G-25-2和G-25-2'的分子量范围分别为651.35～673.33 Da和516.81～1070.6 Da;胰蛋白酶酶解的驼乳和牛乳抗菌肽组分G-25-2和G-25-1'的分子量范围分别为508.24～1438.77 Da 和 533.29～1665.66 Da。5.研究各组分的稳定性及抑菌特性。以大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,测定各组分的最小抑菌浓度和生长曲线的抑制作用,并以大肠埃希氏菌为指示菌研究了高温和不同pH对抗菌活性的影响。结果表明:各组分对高温稳定且在酸性条件下抑菌效果明显,中性条件下抑菌效果变弱,而在碱性条件下,抑菌效果剧烈下降。
【图文】：
２．５．１各蛋白酶单因素试验结果逡逑２．邋５．１．１不同温度对驼乳和牛乳乳清蛋白水解度的影响逡逑从图１中可以看出，四种蛋白酶的水解度均随着温度的升高呈先增大后减小的逡逑趋势，，驼乳和牛乳胃蛋白酶的水解度均在在４０邋°Ｃ时达到最大值，胰蛋白酶和木瓜逡逑蛋丨＇Ｉ酶的水解度均在４５邋°Ｃ时达到最大值，而碱性蛋白酶的水解度则在５０邋°Ｃ时达到逡逑Ｍ人。其原因是由于在一定的温度范围内，温度升高反应物分子获得能量，反应速逡逑率加快，从而使水解度增大，但温度过高会导致蛋白酶变性失活，从而使反应速率逡逑Ｋ降，水解度降低［８７］。对于驼乳乳清蛋白而言木瓜蛋白酶水解物，在４５邋°Ｃ和５０邋°Ｃ逡逑T 的水解度没有明显差异，考虑到酶解温度越高酶的活性越不稳定，因此胃蛋白酶、逡逑胰蛋丨＇丨酶、木瓜蛋内酶和碱性蛋白酶的较适酶解温度分R%为４０邋°Ｃ、４５邋°Ｃ、４５邋°Ｃ和逡逑５０邋°Ｃ；对于牛乳乳清蛋白各蛋白酶水解的最适酶解温度亦分R%为４０邋°Ｃ、４５邋°Ｃ、４５邋°Ｃ逡逑和邋５０邋°Ｃ。逡逑
ｐＨ值过低或者过高都会使酶失活从而影响酶的作用效果。在最佳ｐＨ条件下，逡逑酶保持其最优的空间结构，酶活性中心与底物的结合最好，因此，在最适ｐＨ条件逡逑下，酶具有最佳的催化活性。由图２可知，不同的蛋白酶对酸碱环境的要求不同，逡逑对于驼乳乳清蛋白而言，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶和碱性蛋白酶分别在逡逑ｐＨ＝２，邋ｐＨ＝６，ｐＨ＝８．５和ｐＨ＝９．５时酶解物的水解度达到最大值；而对于牛乳乳清蛋逡逑白而言，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶和碱性蛋白酶分别在ｐＨ＝２．５，邋ｐＨ＝６，逡逑ｐＨ＝８和ｐＨ＝９．５时酶解物的水解度达到最大值。逡逑ｆｉｆｌｌｆｆ—一逦丽丽．１逡逑：ｔｔｍｍ逦－ｏ－ｍｓａｍ邋Ｉ逡逑Ａ逦．．．．．．．＿逦0逦４ｕｍＭ逡逑ｙ＼逦0逦Ｉ－，－铖性蛋＿逡逑？邋ｊ、逦严一逡逑，逦ｒ逦＼逦ｙ逡逑＊邋Ａ逡逑／＼逡逑ｉ．？－逦／逦ｇ逦Ａ逡逑２邋ｚ邋Ｅｌ°＇逦／邋＼逡逑８－八逦Ａ逡逑？ｓ邋－逡逑逦ｊ逦逦逦ｊ逦逦逦＼逦，逦ｔ逦．逦ｓ逦；逡逑２逦１逦贫逦c坼巍慑巍觯ュ喂儒危儒危龋╁义希咤褰忮澹穑儒义贤迹插澹穑榷匀榍宓鞍姿舛鹊挠跋戾义希疲椋纾酰颍澹插澹牛妫妫澹悖翦澹铮驽澹恚椋欤脲澹鳎瑁澹澹瑁洌颍铮欤螅椋箦澹穑儒澹铮铄澹模儒义献ⅲ海粒和杖槿榍宓鞍祝唬拢号Ｈ槿榍宓鞍族义
本文编号：2654406
【图文】：
２．５．１各蛋白酶单因素试验结果逡逑２．邋５．１．１不同温度对驼乳和牛乳乳清蛋白水解度的影响逡逑从图１中可以看出，四种蛋白酶的水解度均随着温度的升高呈先增大后减小的逡逑趋势，，驼乳和牛乳胃蛋白酶的水解度均在在４０邋°Ｃ时达到最大值，胰蛋白酶和木瓜逡逑蛋丨＇Ｉ酶的水解度均在４５邋°Ｃ时达到最大值，而碱性蛋白酶的水解度则在５０邋°Ｃ时达到逡逑Ｍ人。其原因是由于在一定的温度范围内，温度升高反应物分子获得能量，反应速逡逑率加快，从而使水解度增大，但温度过高会导致蛋白酶变性失活，从而使反应速率逡逑Ｋ降，水解度降低［８７］。对于驼乳乳清蛋白而言木瓜蛋白酶水解物，在４５邋°Ｃ和５０邋°Ｃ逡逑T 的水解度没有明显差异，考虑到酶解温度越高酶的活性越不稳定，因此胃蛋白酶、逡逑胰蛋丨＇丨酶、木瓜蛋内酶和碱性蛋白酶的较适酶解温度分R%为４０邋°Ｃ、４５邋°Ｃ、４５邋°Ｃ和逡逑５０邋°Ｃ；对于牛乳乳清蛋白各蛋白酶水解的最适酶解温度亦分R%为４０邋°Ｃ、４５邋°Ｃ、４５邋°Ｃ逡逑和邋５０邋°Ｃ。逡逑
ｐＨ值过低或者过高都会使酶失活从而影响酶的作用效果。在最佳ｐＨ条件下，逡逑酶保持其最优的空间结构，酶活性中心与底物的结合最好，因此，在最适ｐＨ条件逡逑下，酶具有最佳的催化活性。由图２可知，不同的蛋白酶对酸碱环境的要求不同，逡逑对于驼乳乳清蛋白而言，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶和碱性蛋白酶分别在逡逑ｐＨ＝２，邋ｐＨ＝６，ｐＨ＝８．５和ｐＨ＝９．５时酶解物的水解度达到最大值；而对于牛乳乳清蛋逡逑白而言，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶和碱性蛋白酶分别在ｐＨ＝２．５，邋ｐＨ＝６，逡逑ｐＨ＝８和ｐＨ＝９．５时酶解物的水解度达到最大值。逡逑ｆｉｆｌｌｆｆ—一逦丽丽．１逡逑：ｔｔｍｍ逦－ｏ－ｍｓａｍ邋Ｉ逡逑Ａ逦．．．．．．．＿逦0逦４ｕｍＭ逡逑ｙ＼逦0逦Ｉ－，－铖性蛋＿逡逑？邋ｊ、逦严一逡逑，逦ｒ逦＼逦ｙ逡逑＊邋Ａ逡逑／＼逡逑ｉ．？－逦／逦ｇ逦Ａ逡逑２邋ｚ邋Ｅｌ°＇逦／邋＼逡逑８－八逦Ａ逡逑？ｓ邋－逡逑逦ｊ逦逦逦ｊ逦逦逦＼逦，逦ｔ逦．逦ｓ逦；逡逑２逦１逦贫逦c坼巍慑巍觯ュ喂儒危儒危龋╁义希咤褰忮澹穑儒义贤迹插澹穑榷匀榍宓鞍姿舛鹊挠跋戾义希疲椋纾酰颍澹插澹牛妫妫澹悖翦澹铮驽澹恚椋欤脲澹鳎瑁澹澹瑁洌颍铮欤螅椋箦澹穑儒澹铮铄澹模儒义献ⅲ海粒和杖槿榍宓鞍祝唬拢号Ｈ槿榍宓鞍族义
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