方格星虫多糖对电离辐射所致HUVEC和HIEC损伤的防护作用及其机理研究

发布时间：2020-09-10 07:32

　　核技术广泛运用在工业、科研和医疗等方面,在促进社会经济发展的同时对人类的健康也造成了危害。目前,大多数辐射防护剂具有一定的毒副作用,人类不得不寻找既安全又能抗辐射的药物。我们前期开展了方格星虫多糖(Sipunculus nudus polysaccharide,SNP)抗辐射的动物药效学实验,结果发现SNP对电离辐射诱导的小鼠造血和免疫系统等损伤均具有保护作用。为探索SNP的防护作用机制,本实验在以往的基础上,在体外细胞水平开展了研究。具体研究内容和获得的结果如下:1.SNP的提取与制备:从广西北海购买晒干的方格星虫,切段、捣碎,以10%的NaOH碱解,用三氯乙酸脱蛋白,获得粗多糖;用0.1 mg/mL的葡萄糖做标准溶液,于紫外分光光度计490nm的波长处测定吸光度值,绘制标准曲线,于相同波长条件下测定1 mg/mL方格星虫粗多糖的吸光度值,经计算SNP的多糖含量为60%。2.HUVEC和HIEC细胞辐射损伤模型的建立:选取正常人脐静脉内皮细胞和人肠上皮细胞作为~(137)Csγ射线电离辐射损伤效应模型,HUVEC细胞给予0-10 Gy照射,HIEC细胞给予0-20 Gy照射,照射后采用CCK-8法检测细胞存活率;2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy和10 Gy照射后,HUVEC细胞存活率显著下降,分别为87.94%、84.69%、70.25%、65.74%和54.78%;经2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy、15 Gy、20 Gy照射后,HIEC存活率分别为80.39%、76.23%、70.55%、70.82%、66.49%、54.66%和53.12%,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(p0.05,p0.01);且细胞存活率均与辐照剂量呈负相关。根据实验结果,结合相关文献报道,分别选择8 Gy和10 Gy作为HUVEC和HIEC细胞辐射损伤的造模剂量。3.SNP对HUVEC和HIEC辐射防护作用的研究:(1)SNP对细胞的毒性实验结果表明,与DMSO阳性对照组相比,SNP在实验浓度范围内(HUVEC细胞SNP终浓度分别为0.5,1,5,10,50,100,200,500?g/mL,HIEC细胞SNP终浓度分别为1、10、50、100、200、500、1 000μg/mL),对细胞无毒性作用;(2)分别以8 Gy和10 Gy ~(137)Csγ射线对HUVEC和HIEC细胞进行一次性照射,研究不同浓度的SNP对受照细胞增殖的影响情况,结果显示,一定浓度的SNP预处理能改善照射对细胞增殖的抑制作用;(3)采用Giemsa染色观察细胞的克隆形成率,结果显示,与辐照模型组相比,SNP预处理可有效改善照射后细胞的克隆形成能力;(4)采用Hoechst33342/PI双染法结合显微镜下观察细胞凋亡时发现,HUVEC和HIEC细胞的模型组凋亡细胞均较正常对照组增多,SNP预处理后,凋亡细胞均较辐照模型组减少;采用Annexin V/PI染色流式细胞仪定量检测细胞凋亡率时发现,8 Gy照射HUVEC细胞后,其凋亡率显著上升(由1.02%上升至15.6%),而SNP预处理组的辐照细胞凋亡率显著下降至6.8%(P0.01),HIEC经10 Gy照射后细胞凋亡率显著上升(由2.12%上升至14.37%),而经SNP预处理后的辐照细胞凋亡率显著下降至7.18%(p0.01);(5)采用DCFH-DA探针法结合流式细胞术,检测HUVEC和HIEC细胞各组样品中ROS生成水平,结果发现,照射后HUVEC细胞中ROS mean值由32.63?10~4增加到47.10?10~4(p0.01),经SNP预处理后,细胞内ROS mean值降至41.77?10~4(p0.05);HIEC细胞经照射后,其ROS mean值由4.76?10~4增加到16.69?10~4,(p0.01),SNP预处理后,细胞内ROS mean值降至9.81?10~4(p0.01)。(6)采用试剂盒检测HUVEC和HIEC细胞各组样品中抗氧化酶(SOD、CAT、GST、GSH-Px)活性、脂质过氧化物(MDA)和DNA氧化损伤产物—8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量,结果发现,与正常对照组相比,辐照模型组SOD、CAT、GST、GSH-Px活性降低,MDA和8-OHdG含量升高,SNP预处理后细胞中SOD、CAT、GST、GSH-Px活性较辐照模型组增加,MDA和8-OHdG含量较之下降。4.SNP对HUVEC和HIEC辐射防护作用机理的研究:采用流式细胞术对HUVEC和HIEC细胞中DNA双链断裂的标志物γ-H2AX进行检测,发现细胞照射后2、4、8 h,辐照模型组中γ-H2AX均升高,SNP预处理的细胞中γ-H2AX均较辐照模型组低(p0.05,p0.01);采用RT-PCR检测hOGG1和RAD51基因表达时发现,辐照模型组中hOGG1和RAD51的mRNA表达均下调,SNP预处理则显著上调了hOGG1和RAD51的表达。综上,SNP预处理可促进受照细胞增殖和克隆形成,抑制细胞凋亡,能保护抗氧化酶活性,降低MDA和8-OHdG含量含量,减少DNA双链断裂,上调hOGG1和RAD51的表达。结果提示,SNP具有良好的抗辐射作用,其主要作用机制是通过清除自由基、减轻辐射对细胞DNA的氧化损伤、促进DNA修复、减少细胞凋亡,发挥辐射保护作用。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.4
【部分图文】：

细胞凋亡,上流式,细胞内,蓝色荧光

继原条件培养 48 小时。PBS 洗 3 次，在冰上消化收集细胞，用 Annexin V/P进行染色，上流式定量检测各细胞凋亡率，实验重复 3 次。结果如图 4-8 和 4所示，在经过 8 Gy137Cs γ 线辐射后，对照组的凋亡率为 15.6%，而 SNP 预处理组的凋亡率为 6.8%，SNP 组凋亡率的显著降低（P<0.01）。采用 Hoechst33342/PI 法结合显微镜观察 SNP预处理对辐照后HIEC 细胞凋亡的影响，结果见图 4-9。由图 4-9 可知，辐照后 48 h HIEC 细胞蓝色荧光增强，此外，一些细胞内出现亮红色，另外一些细胞内出现暗红色，说明137Cs γ 射线照射至辐射剂量为 10 Gy 后的细胞有凋亡也有坏死，而经过 SNP 预处理后，细胞内蓝色荧光和红色荧光均降低，提示 SNP 能有效改善辐照对细胞的损伤。为进一步验证 SNP 的防护效应，我们采用流式细胞仪定量检测其凋亡率。于辐照后 48 h，冰上消化、离心收集细胞，进行 Annexin V/PI 染色，上流式仪，见图4-11，图中右下象限代表细胞早期凋亡的比率，右上象限分别表示晚期凋亡的比率。由图 4-12 可知，137Cs γ 线辐照后，细胞凋亡率显著上升（由 2.12% 上升至14.37%），并且以早期凋亡细胞为主，而经 SNP 预处理后的辐照细胞凋亡率显著下降，仅为 7.18%，差别有统计学意义（p<0.01），见图 4-12。0Gy SNP(-)8Gy SNP(-)0Gy SNP(+)8Gy SNP(+)

细胞凋亡

图 4-8 流式细胞检测图Fig.4-8 Cell apoptosis analysis by flow cytometry图 4-9 SNP 对 HUVEC 细胞凋亡的影响(** p<0.01,与 0 Gy0 μg/mL SNP 组相比；## p<0.01 与 8 Gy 0 μg/mLSNP 组相比.)Fig.4-9 Effects of SNP on apoptosis of HUVEC cells051015200 8Apoptosisrate(%)Irradiation dose (Gy)SNP（-）SNP（+）**##

细胞凋亡

图 4-10 SNP 对辐照后 HIEC 细胞凋亡的影响图 4-10 SNP 对辐 HIEC 细胞凋亡的影响(Hoechst33342/PI 法)Fig.4-10 Effect of SNP on apoptosis of HIEC cells after irradiation (Hoechst33342/PImethod)0Gy 10GySNP(-)PI-A

【参考文献】