蛋白激酶D1在内质网应激反应中的作用研究

发布时间：2020-03-28 19:48

【摘要】：内质网是细胞中重要的细胞器,负责分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、翻译后修饰及转运等过程,还是细胞内脂类合成及钙离子储存的场所。当内质网中未折叠蛋白累积时内质网的正常功能将会受到影响从而引发内质网应激,激活三条经典的信号通路。这三条信号通路分别由内质网膜上的应激感受器IRE1、PERK和ATF6所介导,也被统称为未折叠蛋白反应。未折叠蛋白反应旨在恢复细胞内环境的稳态,但不可逆的应激条件下未折叠蛋白反应会激活细胞内的凋亡通路,清除机体中严重受损的细胞。内质网应激与诸多重大疾病密切相关,包括神经退行性疾病和肿瘤。然而,未折叠蛋白反应决定细胞命运的详细机制并不十分清楚。蛋白激酶D(Protein Kinase D,PKD)家族是一个丝/苏氨酸激酶家族,且属于钙调蛋白激酶大家族,一共包括三个成员PKD1、PKD2和PKD3。PKD广泛参与调控细胞的增殖、分化、凋亡和分泌等过程,与心肌病和肿瘤等疾病的发生发展密切相关。有报道表明,氧化应激条件下,PKD1被激活进而保护细胞免于氧化应激引发的凋亡过程。考虑到氧化应激和内质网应激的紧密关系,且没有报道明确显示PKD在内质网应激反应中的作用。基于此,本论文针对PKD1与内质网应激反应的相关性进行了研究,同时探究了非ATP竞争型PKD抑制剂的作用模型。首先,在人肝癌细胞HepG2和前列腺癌细胞PC-3中我们发现,内质网应激经由PLC/PKCδ通路激活PKD1。通过蛋白免疫印迹、TUNEL和MTT等实验方法我们发现,PKD1表达沉默或活性抑制能明显增加细胞对内质网应激的敏感性,表现为caspase-3和PARP剪切及细胞凋亡率显著增加。进一步研究发现,内质网应激条件下PKD1能够特异性调控IRE1信号通路。PKD1表达沉默或活性抑制可选择性下调IRE1的蛋白水平,该效应与IRE1转录和翻译过程无关。而蛋白酶体抑制剂MG132能够逆转PKD活性受阻所介导的IRE1蛋白水平降低的效应,表明PKD1参与调控IRE1蛋白的稳定性。PKD1通过促进IRE1蛋白的稳定增强内质网应激所引发的IRE1/XBP1信号通路的激活。内质网应激条件下,高表达IRE1或XBP1s能够下调PKD活性抑制所介导的促细胞凋亡效应,表明PKD1通过IRE1/XBP1通路促进细胞对内质网应激的耐受能力。此外,PKD1还可通过上调MKP1的磷酸化影响内质网应激条件下IRE1/JNK信号通路的活化模式。当抑制PKD1的表达或活性时,内质网应激促MKP1磷酸化的效应降低,导致JNK的激活模式由瞬时型激活转变为长时程的强激活。抑制MKP1活性同样增加内质网应激诱导的细胞凋亡比率。由此可知,PKD1通过两种方式保护细胞免受内质网应激诱导的凋亡:一是维持IRE1蛋白稳定,通过促进内质网应激所介导的IRE1/XBP1通路活性确保该通路的细胞保护效应;二是通过MKP1抑制内质网应激条件下促细胞凋亡的IRE1/JNK信号通路。研究证实,PKD与心肌病和肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关,靶向PKD的药物研发一直备受关注。通过筛选或修饰得到的PKD抑制剂已达几十种,但其激酶域介导抑制剂结合的氨基酸残基并未揭示。基于此,我们通过同源建模、分子对接和定点突变等方法研究了两种PKD非ATP竞争性抑制剂kb-NB 142-70(缩写为kb)和CID755673(缩写为CID)的作用模式。结果表明,PKD激酶区的Leu~(662),Leu~(713)以及Phe~(728)是介导两种抑制剂结合的关键位点;同时,抑制剂与PKD之间的稳定作用依赖于ATP在激酶活性位点的结合。激酶域的Leu~(662),Leu~(713)和Phe~(728)通过疏水相互作用影响抑制剂的作用效果。激酶活性口袋下方的Cys~(726)突变为丙氨酸可显著降低kb的抑制效果,但对CID的没有影响。我们推测,与活性位点Cys~(726)的特异性作用可能是kb的抑制活性高于CID的分子基础。我们的研究结果证实了PKD1是IRE1功能的一个重要调控因子,能够特异性增强内质网应激条件下IRE1信号通路的促细胞生存的作用,同时抑制其促细胞凋亡的效应。表明PKD1在内质网应激决定细胞生死命运的过程中起到了关键作用,这有助于进一步阐明内质网应激机制及其引发的生理病理效应。同时,我们揭示了PKD活性口袋中介导非ATP竞争性抑制剂结合的关键氨基酸残基。成功构建的非ATP竞争性抑制剂的作用模型将为新的高效PKD抑制剂的合理设计提供有力的指导。
【图文】：

未折叠蛋白,细胞凋亡,内质网

2图 1.1 内质网应激诱导未折叠蛋白反应以及细胞凋亡的发生。（A）未折叠蛋白反应压力感受器，IRE1 、PERK 和 ATF6，传递内质网折叠状态信息到细胞质和细胞核中从而恢复其蛋白折叠的能力[13]。（B）当细胞遭受长时间高强度的内质网应激时，PERK 和 IRE1 引起多种信号输出从而导致细胞功能障碍、炎症小体的活化以及凋亡。内质网和线粒体之间通过转录和转录后修饰的 BLC-2 家族蛋白进行相互作用的过程是调控凋亡的关键步骤。此外，内质网中钙离子的释放、加剧的蛋白质合成以及活性氧的产生都是引起凋亡发生的因素[15]。Figure 1.1 Endoplasmic reticulum induces the unfolded protein response and cell apoptosis.(A) The unfolded protein response (UPR) stress sensors, inositol-requiring protein 1 (IRE1 ), proteinkinase R-like endoplasmic reticulum (ER) kinase (PERK) and activating transcription factor 6 (ATF6),transduce information about the folding status of the ER to the cytosol and nucleus to restoreprotein-folding capacity[13]. (B) When exposed to chronically high levels of ER stress, PERK andIRE1 both drive multiple signaling outputs that lead to cell dysfunction, activation of the

蛋白结构,调控机制,磷酸化

华中科技大学博士学位论文的 PKC 家族成员（包括 PKC 、PKC 、PKCη、PKCθ）能够直接磷酸化 PKD1 激酶区域保守的丝氨酸位点[128]。虽然在 PKD1 的激活有一个明显的膜定位过程，但该过程并非是其激活所必须的[129]，而调节区域和激酶区域的解离才是引起 PKD1 激活的关键过程。因此，PKD1 调节区域 CRD 的缺失、PH domain 上特定位点突变或磷酸化[130,131]以及酸性区域上半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（caspase-3）剪切位点被剪切[132]都能够导致 PKD1 活性的增加，，所有这些过程都导致了 PKD1 调节区域和激酶区域的解离。此外，PKD1 的 PH domain 还负责激活过程中 PKD1 与膜上的脂类及其它蛋白的结合，该结合有利于 PKD1 及 PKD1 下游底物的激活[133,134]。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q244

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