基于蛋白纳米胶囊的双重固定化酶体系的构建与应用研究

发布时间：2020-03-31 10:03

【摘要】：工业生物技术一直试图寻找能够长久保持酶活力,并能使其循环使用的方法。酶的固定化可以满足以上的要求,但想要获得高性能的固定化酶通常需要考虑两点:即选择合适的固定化方法和寻找合适的固定化材料。基于以上两点考虑,本研究提出一种基于蛋白质纳米胶囊的新型酶固定化方式——双固定化法。首先采用原位自由基聚合技术在酶分子的表面构建聚合物外壳,形成蛋白质纳米胶囊,然后,蛋白质纳米胶囊与氧化石墨烯(GO)自组装形成双固定化酶。在这里,我们以有机磷水解酶(OPH)为酶模型,制备了有机磷水解酶酶纳米胶囊(nOPH10),再将OPH和nOPH10分别固定于GO上,形成传统固定化酶(OPH@GO)和双固定化酶(nOPH10@GO),并系统研究了固定化酶的酶学性质、催化性能与组装机理,然后基于该双固定化酶开发了有机磷农药(OPs)检测生物传感器。通过两步法完成了酶纳米胶囊的合成,先对酶表面丙烯酰化处理,再胶囊化反应得到纳米胶囊。以相对酶活为优化指标,通过单因素实验探索制备nOPHs的最佳工艺条件,最终得到nOPH10的相对酶活为97.3%。采用扫描电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和动态光散射仪(DLS)等多种表征手段研究了 nOPH10的物化性质。与原酶OPH相比,nOPH10的粒径增加,表面带电量和电荷性质发生变化,并表现出明显不同的电泳特征。综合上述结果确认得到的酶纳米胶囊具有“壳-核”结构。采用改进的Hummers法制备GO作为固定化载体。在非共价作用力下,GO分别与OPH和nOPH1O自组装形成了 OPH@GO和nOPH10@GO。采用AFM、DLS、激光共聚焦显微镜(CLSM)和圆二色光谱(CD)等研究了固定化酶的形貌与结构,确认成功地构建了双固定化酶体系。进一步研究发现nOPH10在GO上的固载效率要高于OPH的固载效率。机理研究表明nOPH10与GO之间主要是静电力和氢键协同作用,而OPH与GO之间主要是疏水作用力。研究了固定化酶的酶学参数、催化性能与稳定性。与OPH相比,OPH@GO的酶活降低,米氏常数(Km)和催化常数(kcat)均升高,二者比值kcat/Km降低,而nOPH10@GO的上述指标均升高。热稳定性nOPH10@GOOPH@GOOPH;OPH,OPH@GO和nOPH10@GO维持90%以上相对酶活的pH范围分别为7.6～8.7,7.2～9.0和6.5～9.2;体积分数为20%的甲醇中,nOPH10@GO的酶活(60%)分别是OPH(20.3%)和OPH@GO(22.0%)的近三倍;nOPH10@GO冻融循环五次保留75%相对酶活,储存30天酶活未显著降低,循环使用10次保留90%以上酶活,均要优于OPH和OPH@GO。基于OPH@GO和nOPH10@GO分别构建OPs检测生物传感器OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE。以氧化峰值电流为优化指标,得到最优的固定化酶用量为6 μμL,Nafion溶液的用量为6μL。SEM表征发现OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE的表面粗糙且有许多通道。EIS测定显示,滴加固定化酶修饰后,电极的阻抗增加。进一步研究发现OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE表面的传质类型均为扩散控制,且前者的响应电流、pH适应性、精密度、重现性和储存稳定性均高于OPH@GO/GCE。这和使用不同类型的固定化酶自身催化性能和适应性能有关。
【图文】：

方法,交联法,固定化方法,包埋法

同时扩大酶的应用领域。迄今为止，酶的固定化方法己经多达上百种，然而没有一逡逑种技术可以适用于所用酶的周定化［１２；１３］。这是因为不同的应用场合和目的，需要采用不逡逑同的固定化策略。如图１－１所示，常见的酶固定化策略可以分为：交联法、包埋法以及逡逑酶与载体结合法［１４］。其中，酶与载体结含法又可根据二者之间的作用方式不同分为共价逡逑结合和非共价结合。每种酶固定化方法都有自ａ的优点和缺点，因而，寻找一种合适的逡逑固定化方法是构建高性能梒定化酶的重要步骤之一。此外，想要达到酶活＿收率高、稳逡逑定性好、制备ｆ艺简单的直的，固定化材料的选择也？常童要［１５，１６］。通常根据材料自身逡逑的性质，可以将其分为有机固定化载体和无机固定化载体。逡逑，公灄？、逡逑交联法逦包埋法逡逑、非共价结合酶与载体结栜共价结合ｙ逡逑图１－１酶的常见周定化方法逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｏｍｅ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄｓ邋ｆｏｒ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ逡逑１．２．１固定化方法及原理逡逑１．２．１．１交联法逡逑交联法是指采用双功能试剂将酶分子交联在一起，形成酶聚集体以达到固定化的目逡逑的。交联后形成的酶聚集体粒径一般在１－１００邋ｐｍ

交联法,固定化酶,包埋法

包埋法是借助物理方法或者化学方法将酶分子限定于载体的内部空间或通道中而逡逑实现酶的固定化［１６，２８］。常见的包埋载体包括有机高分子聚合物，硅溶胶－凝胶、孔状纤维逡逑和微胶囊等［２９］。图１－３为采用硅溶胶－凝胶法制备固定化酶的工艺［３（３］。通过包埋法制备逡逑的固定化酶可以最大限度的保持酶的活力，这是因为包埋法避免了酶与载体的直接作用，逡逑使得酶的高级结构在制备过程中保持完整《糌益于包埋法上述的优点：，关于采用包埋法逡逑Ｍ定化酶的文献报道．层出不穷＾Ｓｈａｐｏｖａｌｏｖａ等人［３１］采用溶胶－凝胶氧化铝包埋碳酸酐酶、逡逑酸性磷酸酶和辣根过氧化物酶，发现包埋之后，酶的紫外线稳定性增加。Ｆａｔｈａｌｉ等人Ｐ２］逡逑研究了包埋－交联结合法固定化漆酶，并成功应用于催化脱除苯酚。Ｏｌｉｖｅｉｒａ等人［３３］测试逡逑了海藻酸盐包埋固定化果胶酶的热力学和动力学参数，发现随着温度的增加，原酶和固逡逑定化酶的一阶热变性常数均增加。虽然包埋法拥有很多优点，，但该方法也存在严童的缺逡逑３逡逑
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q814.2

【参考文献】