少孢节丛孢双敲除菌株的构建及对生物合成基因的功能研究

发布时间：2020-04-05 23:12

【摘要】：捕食线虫真菌少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生一类特有的可以调控菌丝形态的信号小分子-少孢素类化合物(Arthrosporols)。本课题组前期通过单基因敲除方法,鉴定了位于AOL_s00215g基因簇上参与少孢素类化合物生物合成的9个关键基因283-276和基因274,但对其中的274、280、276、277、278这五个基因的生物合成功能仍未完全解析,本论文通过构建双敲除突变菌株来研究这些生物基因的功能。主要结果和创新:1、利用潮霉素和氯嘧磺隆为筛选标记,成功构建四株少孢节丛孢双基因敲除突变菌株Δ280A274、Δ278A277、Δ276A277、Δ259A911。2、双敲除菌株Δ280A274菌丝形态与单敲除菌株Δ280更相似,比单敲除菌株A274的菌丝更为茂盛;Δ280Δ274生长速度要比Δ280、Δ274、野生菌株分别慢28.0%、30.3%、30.7%。在24h,Δ280A274捕器数量比Δ280、A274、野生型菌株分别增加0.2倍、2.5倍、5.7倍。在孢子产量上,A280A274比野生型少98.9%,比A274少99.4%,但是比Δ280的增加2倍。基因280敲除比基因274敲除对菌丝形态、孢子产量、捕器数量影响更大,A280A274的菌丝形态、孢子产量、捕器数量更接近A280。3、双敲除菌株A259A911菌丝形态与单敲除菌株A259更相似,但生长速度比Δ259快6.7%,比单基因敲除菌株A911慢7.3%,比野生菌株慢l17.2%。在孢子产量上,Δ259Δ911比Δ259减少81.2%,比Δ911和野生型菌株均少99%以上。基因259敲除比基因911敲除对菌丝形态、孢子产量影响更大,A259A911的菌丝形态、孢子产量更接近Δ259。4、双敲除菌株A278A277的菌丝形态与单敲除菌株A278更相似,但是生长速度比A278快5.0%,比单基因敲除菌株A277慢5.6%,比野生型菌株慢7.3%;在孢子产量上,A278A277比A278减少57.4%,比A277和野生型菌株均减少约99%。敲除基因278比敲除基因277对菌丝形态、孢子产量影响更大,A278A277菌丝形态、孢子产量更接近Δ278。5、在PDA、TYGA、YMA培养基中,双基因敲除菌株Δ276Δ277生长速度比单基因敲除菌株A276慢7.8%,在PDA、TYGA培养基中,Δ276Δ277生长速度比Δ277快2.9%。在12h,A276A277捕器数量比A277增加30.0%,比A276增加4.3%,而此时野生型无成熟的三维菌网。在孢子产量上,A276A277比A276减少16.0%,比野生型菌株减少30.4%,但比Δ277增加17.7%。基因276、基因277敲除对菌丝生长、菌丝形态、孢子产量有不同程度的影响,因而Δ276A277菌丝生长、孢子产量介于A276和A277之间,菌丝形态与野生型相似。6、双敲除菌株Δ280A274发酵液粗提物的LC-MS的图谱,在保留时间35.98min出现了[M+H]+343.226310峰,这与少孢素生物合成的关键中间体三元环氧化合物的343.22632对应。同时A280A274与Δ274有4相同的特有峰分别是:275.163[M+H]+(19.34min)、313.20059[M+H]+(20.67min)、343.22638[M+H]+(35.92min)、327.23126[M+H]+(39.47min),与A280有2 个相同的特有峰是243.08742[M+H]+(15.80min)、267.11878[M+H]+(18.38min)。基因259敲除以后代谢图谱变化很大,大量产物消失,与少孢素生物合成最上游基因283敲除后的变化相似,而菌株Δ911与野生型的代谢图谱一致,双敲除菌株Δ259Δ911的代谢图谱与Δ259与一致。双敲除菌株Δ277Δ278的代谢图谱与Δ277一致,且Δ277代谢图谱中没有出现含有C15的法尼基杂合小分子,而Δ278中显示出含有C15的法尼基杂合小分子,表明基因277作用在基因278前面。双敲除菌株Δ276Δ277的代谢图谱与Δ276一致,且Δ276代谢图谱中没有出现PKS-TPS杂合小分子,以及峰的消失比Δ277更多,表明在少孢素生物合成途径中基因276作用应在基因277前面。本实验中通过构建双敲除菌株研究功能相似或相关的两个基因之间对菌丝生长、菌丝形态、孢子产量、孢子萌发、捕器数量和捕食线虫能力方面。发现双基因敲除菌株在形态和孢子萌发、捕器数量和捕食线虫能力上更偏向于引起差异变化更大的单基因敲除菌株。
【图文】：

基因簇,生物合成途径

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青霉,短链,氨基酸序列,基因

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【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q933

【参考文献】